Biblioteca de referencia de cultivo celular
Qué es realmente cada medio, tampón y reactivo: su composición, para qué se usa y en qué se diferencia de las alternativas. Escrito para el laboratorio, no para un folleto.
Media and formulations
Medio químicamente definido
Un medio químicamente definido es un medio de cultivo celular en el que se conocen la identidad y la concentración de todos sus componentes: sin suero, sin hidrolizados de proteínas y sin extractos indefinidos. Puede contener proteínas, siempre que sean recombinantes y de secuencia y concentración conocidas; por eso «químicamente definido» y «sin proteínas» son categorías distintas y no sinónimos. Los medios químicamente definidos eliminan la variabilidad entre lotes, el riesgo de agentes adventicios y la carga regulatoria asociados al suero, y son el estándar en la producción biofarmacéutica con sistemas CHO, HEK293 e hibridomas.
→Medio RPMI 1640
El RPMI 1640 es un medio de cultivo celular basal desarrollado en el Roswell Park Memorial Institute en 1966 para el cultivo de leucocitos humanos en suspensión. Contiene 2000 mg/L de glucosa (11.1 mM), 2000 mg/L de bicarbonato de sodio (23.8 mM) tamponados para una atmósfera de 5% CO2, una concentración de fosfato inusualmente alta (unos 5.6 mM), poco calcio (unos 0.42 mM) y un conjunto de componentes característico que incluye glutatión reducido, biotina, vitamina B12, ácido paraaminobenzoico e hidroxiprolina. Es el medio estándar para linfocitos, hibridomas y la mayoría de las líneas hematopoyéticas y linfoides adaptadas a suspensión, y normalmente se suplementa con un 10% de suero fetal bovino.
→MEM alfa (α-MEM) y medio esencial mínimo
El MEM alfa (α-MEM) es el medio esencial mínimo de Eagle enriquecido con todos los aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, ácido lipoico, ácido ascórbico, biotina y vitamina B12, y se suministra con o sin ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos. Utiliza la misma base salina que el MEM —2200 mg/L de bicarbonato de sodio ajustados a una atmósfera de 5% CO2, 1000 mg/L de glucosa y 1.8 mM de calcio— y es el medio estándar para células estromales mesenquimales, cultivos de médula ósea, osteoblastos, selección de CHO-DXB11 y CHO-DG44 y muchos tipos de células primarias. La versión sin nucleósidos es imprescindible para los sistemas de selección basados en HAT y en metotrexato.
→Reagents and buffers
Tampón HEPES en el cultivo celular
El HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico) es un tampón orgánico zwitteriónico que se emplea en cultivo celular para mantener el medio a pH fisiológico sin depender del CO2 del incubador. Su pKa es de unos 7,5 a 20-25 °C y de unos 7,3 a 37 °C, lo que ofrece una capacidad tamponante útil en un intervalo aproximado de pH 6,8-8,2, y habitualmente se añade al medio a 10-25 mM a partir de una disolución madre estéril 1 M. Como la acción tamponante del HEPES no depende del equilibrio ácido carbónico/bicarbonato, el medio suplementado con HEPES resiste la rápida deriva alcalina que se produce cuando un frasco sale de un incubador con 5% de CO2.
→HBSS (solución salina equilibrada de Hank)
El HBSS (solución salina equilibrada de Hank) es una solución salina equilibrada isotónica que se emplea para lavar células, transportar tejido, diluir reactivos y mantener células durante periodos breves fuera de su medio de cultivo. Contiene 8.0 g/L de cloruro de sodio, 1.0 g/L de D-glucosa, fosfato y 350 mg/L de bicarbonato de sodio, y se suministra con calcio y magnesio (1.26 mM de Ca y ~0.9 mM de Mg totales) o sin ellos. Su bajo contenido de bicarbonato significa que está diseñado para usarse a CO2 atmosférico o en recipientes cerrados, no para cultivos prolongados en un incubador con 5% CO2.
→Azul de tripano y el ensayo de viabilidad por exclusión de colorante
El azul de tripano es un colorante diazoico que se emplea al 0.4% (p/v) para separar las células vivas de las muertas mediante exclusión de colorante: una membrana plasmática intacta impide la entrada del colorante cargado, de modo que las células viables permanecen transparentes y refringentes, mientras que las células con la membrana dañada lo incorporan y se tiñen de azul. En la práctica, la suspensión celular se mezcla 1:1 con azul de tripano al 0.4%, se carga en un hemocitómetro o en un contador celular automático y se cuenta en un plazo de 3-5 minutos para obtener a la vez una concentración celular y un porcentaje de viabilidad. Como solo informa sobre la integridad de la membrana, el azul de tripano cuenta las células que ya han muerto: no detecta células apoptóticas ni metabólicamente deterioradas que aún conservan la membrana intacta, por lo que da valores más altos que los ensayos de viabilidad metabólicos o por citometría de flujo.
→Tampón de lisis ACK
El tampón de lisis ACK (cloruro de amonio-potasio) es una solución isotónica de cloruro de amonio que se emplea para eliminar los eritrocitos de preparaciones de leucocitos como el bazo de ratón, la médula ósea y la capa leucocitaria. La composición estándar es 150 mM de cloruro de amonio (8.02 g/L de NH4Cl), 10 mM de bicarbonato de potasio (1.0 g/L de KHCO3) y 0.1 mM de EDTA disódico, ajustada a pH 7.2-7.4. Los eritrocitos se lisan osmóticamente en uno a cinco minutos a temperatura ambiente, porque su intercambiador aniónico banda 3 y su elevada actividad anhidrasa carbónica impulsan la entrada de cloruro de amonio y agua en la célula, mientras que los leucocitos, que carecen de esa capacidad de transporte, sobreviven.
→Puromicina para la selección de células de mamífero
La puromicina es un antibiótico aminonucleósido producido por Streptomyces alboniger que imita el extremo aminoacilo del ARNt, entra en el sitio A ribosómico y provoca la liberación prematura de una cadena peptídica truncada, con lo que mata a las células incapaces de inactivarla. En cultivo de células de mamífero se emplea como agente de selección a 0.5-10 ug/mL, lo más habitual 1-2 ug/mL, y elimina las células no resistentes más rápido que cualquier otro antibiótico de selección común: normalmente en 2-5 días. La resistencia la confiere el gen pac, que codifica la puromicina N-acetiltransferasa, la cual acetila el fármaco y lo deja inactivo. Como la concentración eficaz depende mucho de la línea celular, de la densidad celular y del contenido de suero, hay que realizar una curva de mortalidad para cada nueva línea celular y cada nuevo lote de puromicina.
→Protocols and methods
Contamination and quality control
Contaminación en el cultivo celular
La contaminación del cultivo celular se agrupa en seis categorías: bacterias, levaduras, hongos filamentosos y mohos, micoplasma, virus y contaminación cruzada con otra línea celular. Las bacterias, las levaduras y los hongos se manifiestan en un plazo de uno a cinco días mediante turbidez, un cambio de pH o partículas visibles al microscopio, y se resuelven descartando el cultivo y localizando el fallo de técnica que permitió su entrada. El micoplasma, la contaminación viral y la identificación errónea de la línea celular no producen ningún cambio visible y solo se detectan mediante ensayos: PCR o tinción de ADN para el micoplasma, y perfil de STR para la identidad. La respuesta correcta ante cualquier contaminación biológica confirmada es descartar el cultivo afectado, descontaminar el incubador y reiniciar a partir de un vial congelado limpio.
→Ensayo de endotoxinas en el cultivo celular
El ensayo de endotoxinas mide el lipopolisacárido bacteriano (LPS) presente en el agua de laboratorio, los medios, los sueros y los reactivos, y se expresa en unidades de endotoxina por mililitro (EU/mL), donde 1 EU equivale aproximadamente a 0.1–0.2 ng de la endotoxina de E. coli del estándar de referencia. Los métodos oficiales son el ensayo LAL (lisado de amebocitos de Limulus) en sus formatos de gelificación, turbidimétrico y cromogénico, recogidos en el capítulo USP <85>, y el ensayo con Factor C recombinante (rFC), libre de origen animal, recogido en USP <86>; los formatos cinéticos cuantifican hasta cerca de 0.001–0.005 EU/mL. Los límites prácticos en cultivo celular son 0.25 EU/mL para el agua, ≤1 EU/mL para la mayoría de los reactivos de grado cultivo celular y ≤10 EU/mL como estándar general del sector para el suero fetal bovino, con grados de baja endotoxina a ≤1 EU/mL y grados de endotoxina ultrabaja por debajo de 0.1 EU/mL. La endotoxina sobrevive al autoclave y atraviesa los filtros de 0.2 µm, de modo que hay que excluirla en el origen en lugar de intentar eliminarla después.
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