Biblioteca de referencia de cultivo celular
Qué es realmente cada medio, tampón y reactivo: su composición, para qué se usa y en qué se diferencia de las alternativas. Escrito para el laboratorio, no para un folleto.
Media and formulations
Medio químicamente definido
Un medio químicamente definido es un medio de cultivo celular en el que se conocen la identidad y la concentración de todos sus componentes: sin suero, sin hidrolizados de proteínas y sin extractos indefinidos. Puede contener proteínas, siempre que sean recombinantes y de secuencia y concentración conocidas; por eso «químicamente definido» y «sin proteínas» son categorías distintas y no sinónimos. Los medios químicamente definidos eliminan la variabilidad entre lotes, el riesgo de agentes adventicios y la carga regulatoria asociados al suero, y son el estándar en la producción biofarmacéutica con sistemas CHO, HEK293 e hibridomas.
→Medio RPMI 1640
El RPMI 1640 es un medio de cultivo celular basal desarrollado en el Roswell Park Memorial Institute en 1966 para el cultivo de leucocitos humanos en suspensión. Contiene 2000 mg/L de glucosa (11.1 mM), 2000 mg/L de bicarbonato de sodio (23.8 mM) tamponados para una atmósfera de 5% CO2, una concentración de fosfato inusualmente alta (unos 5.6 mM), poco calcio (unos 0.42 mM) y un conjunto de componentes característico que incluye glutatión reducido, biotina, vitamina B12, ácido paraaminobenzoico e hidroxiprolina. Es el medio estándar para linfocitos, hibridomas y la mayoría de las líneas hematopoyéticas y linfoides adaptadas a suspensión, y normalmente se suplementa con un 10% de suero fetal bovino.
→MEM alfa (α-MEM) y medio esencial mínimo
El MEM alfa (α-MEM) es el medio esencial mínimo de Eagle enriquecido con todos los aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, ácido lipoico, ácido ascórbico, biotina y vitamina B12, y se suministra con o sin ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos. Utiliza la misma base salina que el MEM —2200 mg/L de bicarbonato de sodio ajustados a una atmósfera de 5% CO2, 1000 mg/L de glucosa y 1.8 mM de calcio— y es el medio estándar para células estromales mesenquimales, cultivos de médula ósea, osteoblastos, selección de CHO-DXB11 y CHO-DG44 y muchos tipos de células primarias. La versión sin nucleósidos es imprescindible para los sistemas de selección basados en HAT y en metotrexato.
→DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco)
El DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) es un medio de cultivo celular basal derivado del medio esencial mínimo de Eagle, obtenido al multiplicar aproximadamente por cuatro las concentraciones de aminoácidos y vitaminas. Se suministra en versiones de glucosa alta (4500 mg/L, 25 mM) y glucosa baja (1000 mg/L, 5.6 mM), tamponado con 3700 mg/L de bicarbonato de sodio, y necesita suero o un suplemento definido más una atmósfera de CO2 para mantener el pH fisiológico. El DMEM es el medio por defecto para líneas adherentes como HEK293, HeLa, NIH/3T3, Vero y los cultivos adherentes derivados de CHO, así como para la mayoría de los fibroblastos primarios.
→El rojo de fenol en los medios de cultivo celular
El rojo de fenol (fenolsulfonftaleína) es un indicador de pH que se añade a los medios de cultivo celular a razón de unos 5-15 mg/L; vira a amarillo por debajo de aproximadamente pH 6,8 y a rosa o fucsia por encima de aproximadamente pH 8,2, mientras que el rojo anaranjado normal de un medio sano se sitúa cerca de pH 7,4. Que el medio se vuelva amarillo significa acidificación —casi siempre por el lactato del metabolismo celular, por un cultivo sobrecrecido o por contaminación bacteriana—, mientras que un viraje a rosa o púrpura significa que el medio se ha alcalinizado, casi siempre porque el CO2 ha escapado del tampón de bicarbonato. El rojo de fenol no ejerce ninguna acción tamponante y es puramente diagnóstico; utilice medio sin rojo de fenol para los ensayos de fluorescencia y absorbancia, y para el trabajo con células sensibles a los estrógenos, donde el colorante interfiere en la lectura.
→Reagents and buffers
Tampón HEPES en el cultivo celular
El HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico) es un tampón orgánico zwitteriónico que se emplea en cultivo celular para mantener el medio a pH fisiológico sin depender del CO2 del incubador. Su pKa es de unos 7,5 a 20-25 °C y de unos 7,3 a 37 °C, lo que ofrece una capacidad tamponante útil en un intervalo aproximado de pH 6,8-8,2, y habitualmente se añade al medio a 10-25 mM a partir de una disolución madre estéril 1 M. Como la acción tamponante del HEPES no depende del equilibrio ácido carbónico/bicarbonato, el medio suplementado con HEPES resiste la rápida deriva alcalina que se produce cuando un frasco sale de un incubador con 5% de CO2.
→HBSS (solución salina equilibrada de Hank)
El HBSS (solución salina equilibrada de Hank) es una solución salina equilibrada isotónica que se emplea para lavar células, transportar tejido, diluir reactivos y mantener células durante periodos breves fuera de su medio de cultivo. Contiene 8.0 g/L de cloruro de sodio, 1.0 g/L de D-glucosa, fosfato y 350 mg/L de bicarbonato de sodio, y se suministra con calcio y magnesio (1.26 mM de Ca y ~0.9 mM de Mg totales) o sin ellos. Su bajo contenido de bicarbonato significa que está diseñado para usarse a CO2 atmosférico o en recipientes cerrados, no para cultivos prolongados en un incubador con 5% CO2.
→Azul de tripano y el ensayo de viabilidad por exclusión de colorante
El azul de tripano es un colorante diazoico que se emplea al 0.4% (p/v) para separar las células vivas de las muertas mediante exclusión de colorante: una membrana plasmática intacta impide la entrada del colorante cargado, de modo que las células viables permanecen transparentes y refringentes, mientras que las células con la membrana dañada lo incorporan y se tiñen de azul. En la práctica, la suspensión celular se mezcla 1:1 con azul de tripano al 0.4%, se carga en un hemocitómetro o en un contador celular automático y se cuenta en un plazo de 3-5 minutos para obtener a la vez una concentración celular y un porcentaje de viabilidad. Como solo informa sobre la integridad de la membrana, el azul de tripano cuenta las células que ya han muerto: no detecta células apoptóticas ni metabólicamente deterioradas que aún conservan la membrana intacta, por lo que da valores más altos que los ensayos de viabilidad metabólicos o por citometría de flujo.
→Tampón de lisis ACK
El tampón de lisis ACK (cloruro de amonio-potasio) es una solución isotónica de cloruro de amonio que se emplea para eliminar los eritrocitos de preparaciones de leucocitos como el bazo de ratón, la médula ósea y la capa leucocitaria. La composición estándar es 150 mM de cloruro de amonio (8.02 g/L de NH4Cl), 10 mM de bicarbonato de potasio (1.0 g/L de KHCO3) y 0.1 mM de EDTA disódico, ajustada a pH 7.2-7.4. Los eritrocitos se lisan osmóticamente en uno a cinco minutos a temperatura ambiente, porque su intercambiador aniónico banda 3 y su elevada actividad anhidrasa carbónica impulsan la entrada de cloruro de amonio y agua en la célula, mientras que los leucocitos, que carecen de esa capacidad de transporte, sobreviven.
→Trypsin-EDTA
El Trypsin-EDTA es un reactivo de disociación celular que combina la tripsina, una serina proteasa que corta enlaces peptídicos por el lado C-terminal de los residuos de lisina y arginina en las proteínas de superficie y de la matriz, con el quelante EDTA, que fija los iones calcio y magnesio que necesitan las moléculas de adhesión celular. Se suministra en una solución salina equilibrada sin calcio ni magnesio, lo más habitual al 0.05% de tripsina (0.5 g/L) para líneas celulares de rutina y al 0.25% (2.5 g/L) para células firmemente adheridas y cultivos primarios. El uso típico son 2-5 minutos a 37 °C, seguidos de inmediato por la neutralización con medio con suero o con un inhibidor de tripsina definido.
→Puromicina para la selección de células de mamífero
La puromicina es un antibiótico aminonucleósido producido por Streptomyces alboniger que imita el extremo aminoacilo del ARNt, entra en el sitio A ribosómico y provoca la liberación prematura de una cadena peptídica truncada, con lo que mata a las células incapaces de inactivarla. En cultivo de células de mamífero se emplea como agente de selección a 0.5-10 ug/mL, lo más habitual 1-2 ug/mL, y elimina las células no resistentes más rápido que cualquier otro antibiótico de selección común: normalmente en 2-5 días. La resistencia la confiere el gen pac, que codifica la puromicina N-acetiltransferasa, la cual acetila el fármaco y lo deja inactivo. Como la concentración eficaz depende mucho de la línea celular, de la densidad celular y del contenido de suero, hay que realizar una curva de mortalidad para cada nueva línea celular y cada nuevo lote de puromicina.
→Penicilina-estreptomicina y antibiótico-antimicótico en cultivo celular
La penicilina-estreptomicina, abreviada universalmente como Pen-Strep, se suministra como solución estéril 100X con 10000 unidades/mL de penicilina G y 10000 ug/mL de estreptomicina, y se diluye 1:100 en el medio para obtener una concentración de trabajo de 100 U/mL de penicilina y 100 ug/mL de estreptomicina. La penicilina bloquea la síntesis de la pared bacteriana y cubre sobre todo organismos grampositivos; la estreptomicina se une a la subunidad ribosómica 30S bacteriana y cubre sobre todo gramnegativos, de modo que la pareja ofrece una cobertura antibacteriana amplia. El antibiótico-antimicótico (anti-anti) es la misma combinación más 25 ug/mL de anfotericina B a 100X, lo que da 0.25 ug/mL en uso para cubrir hongos. Ninguno de los dos controla el micoplasma, y los grandes bancos celulares, incluido ATCC, desaconsejan el uso rutinario de antibióticos porque enmascara la contaminación de bajo nivel en lugar de prevenirla.
→Suero bovino en cultivo celular
El suero bovino es la fracción líquida de la sangre coagulada de ganado vacuno y se añade al medio de cultivo al 5-10% para aportar los factores de crecimiento, hormonas, proteínas de transporte y de adhesión, lípidos y elementos traza que los medios basales no contienen. El suero fetal bovino (FBS) y el suero fetal de ternera (FCS) son dos nombres del mismo producto, obtenido del feto en el sacrificio de vacas gestantes; el suero de ternera recién nacida procede de terneros de menos de unos 20 días y el suero bovino de donante de rebaños de donantes controlados de entre 12 y 36 meses, y ambos contienen más inmunoglobulinas y menos factores de crecimiento que el FBS. Como el suero es un material biológico indefinido, con una variación sustancial entre lotes, cuestiones de bienestar animal sin resolver y una cadena de suministro inestable, los medios definidos sin suero y libres de origen animal se prefieren cada vez más siempre que la línea celular los tolere.
→El yodixanol como medio de gradiente de densidad
El yodixanol es un compuesto yodado no iónico y soluble en agua que se emplea como medio de gradiente de densidad, y se suministra como solución estéril al 60% (p/v) con una densidad de 1.32 g/mL. Su ventaja definitoria es que resulta isoosmótico en todo el intervalo útil de densidad -- una solución al 60% tiene una osmolalidad de aproximadamente 290 mOsm/kg --, de modo que células, orgánulos, virus y vesículas extracelulares pueden bandearse a densidades altas sin la deshidratación osmótica que provoca la sacarosa ni la elevada fuerza iónica del cloruro de cesio. Es el medio estándar para la purificación de AAV a escala de laboratorio, donde un gradiente de cuatro escalones del 15%, 25%, 40% y 60% separa las cápsides que contienen genoma en la interfase 40-60%, y también se usa ampliamente para la separación de células, el fraccionamiento de orgánulos y la flotación de vesículas extracelulares.
→Disolución de glucosa en cultivo celular
Una disolución de glucosa para cultivo celular es una disolución madre estéril y concentrada de D-glucosa, suministrada habitualmente a 300-450 g/L (30-45 % p/v), que se emplea para suplementar los medios basales y para alimentar cultivos que consumen glucosa más rápido de lo que el medio la aporta. La D-glucosa tiene una masa molecular de 180,16, de modo que 1 g/L equivale a 5,55 mM: los medios estándar van desde 1 g/L (5,5 mM) en el DMEM bajo en glucosa, pasando por 2 g/L (11,1 mM) en el RPMI 1640, hasta 4,5 g/L (25 mM) en el DMEM alto en glucosa. La glucosa se añade para evitar su agotamiento en cultivos prolongados o de alta densidad, y normalmente se esteriliza por filtración en lugar de en autoclave, porque calentar glucosa junto con aminoácidos genera productos de pardeamiento.
→Tampones para cultivo celular
Los tampones para cultivo celular mantienen el medio en el intervalo de pH 7,2-7,4 que necesitan las células de mamífero, frente a la carga ácida que estas generan al metabolizar. El sistema por defecto en casi todos los medios clásicos es el bicarbonato de sodio trabajando con el CO2 de la atmósfera del incubador, motivo por el cual el contenido de bicarbonato debe ajustarse a la configuración del incubador: unos 1,5-2,2 g/L de NaHCO3 para 5 % de CO2 y 3,7 g/L para 10 % de CO2. Los tampones orgánicos como el HEPES (pKa 7,48) se añaden a 10-25 mM para mantener el pH cuando los cultivos están fuera de una atmósfera de CO2, mientras que las disoluciones tamponadas con fosfato, como el PBS y el DPBS, se emplean para el lavado y la manipulación de corta duración, no para el crecimiento.
→Albúmina humana recombinante en cultivo celular
La albúmina sérica humana recombinante (rHSA) es una proteína no glucosilada de 585 aminoácidos y 66,5 kDa producida en levaduras como *Pichia pastoris* o en arroz transgénico, en lugar de purificarse a partir de plasma humano, y se emplea como suplemento libre de origen animal en medios de cultivo sin suero y químicamente definidos. En cultivo actúa como transportador de ácidos grasos, lípidos, hormonas y oligoelementos, como antioxidante gracias al tiol libre de su cisteína-34, como secuestrante de metales tóxicos y del exceso de ácidos grasos libres, y como proteína tensioactiva que protege frente a la cizalla en cultivos agitados y con burbujeo. Las concentraciones de trabajo habituales son de 0,1-10 g/L, con mayor frecuencia de 0,5-5 g/L, y se suministra normalmente como disolución de 200 mg/mL (20 %). Su rendimiento depende en gran medida de lo que lleve unido, de modo que las preparaciones cargadas de ácidos grasos y las libres de ácidos grasos se comportan de forma bastante distinta.
→Dispasa
La dispasa, comercializada también como dispasa II o proteasa neutra, es una metaloproteasa dependiente de zinc de Paenibacillus (antes Bacillus) polymyxa, EC 3.4.24.4, que se emplea para la disociación suave de tejidos y para desprender células y láminas epiteliales intactas. Corta la fibronectina y el colágeno de tipo IV, degrada solo mínimamente el colágeno de tipo I y no corta la laminina ni el colágeno de tipo V, y por eso permite separar una epidermis de la dermis o levantar una lámina epitelial confluente del plástico sin destruir las uniones intercelulares. Como es una metaloproteasa que necesita zinc para la catálisis y calcio para su estabilidad, la inhiben el EDTA, el EGTA y la 1,10-fenantrolina, y debe diluirse en un tampón con calcio y nunca en uno basado en quelantes.
→Insulina humana recombinante en el cultivo celular
La insulina humana recombinante es una proteína de dos cadenas, de 51 aminoácidos y 5.8 kDa, que se emplea como suplemento esencial en medios sin suero y químicamente definidos, donde impulsa la captación de glucosa y aminoácidos, la síntesis de proteínas y lípidos y la supervivencia celular. Se produce en *E. coli* o en levaduras en lugar de extraerse de páncreas animal, por lo que es libre de origen animal, y suele suministrarse como polvo seco estabilizado con zinc. La concentración de trabajo habitual es de 5-10 ug/mL, la que aporta un suplemento ITS estándar a 1X, unas mil veces por encima de los niveles fisiológicos de insulina: a esa concentración la insulina actúa en buena medida a través del receptor de IGF-1 además del suyo propio. Como la insulina es poco soluble cerca del pH neutro, el polvo debe disolverse en ácido clorhídrico o acético diluido antes de diluirlo en el medio.
→Sera, supplements and cell lines
Células Sf9 y el sistema de expresión con baculovirus
Sf9 es una línea celular clonal de insecto aislada a partir de Sf21, que a su vez se estableció a partir de tejido ovárico pupal del gusano cogollero *Spodoptera frugiperda*. Es el hospedador estándar del sistema de vectores de expresión de baculovirus, empleado para producir proteínas recombinantes, partículas similares a virus y AAV. Las células Sf9 crecen a 27 C sin CO2 en medios para insecto tamponados con fosfato a pH 6.2-6.4, se adaptan con facilidad al cultivo en suspensión sin suero a 100-130 rpm y se duplican cada 18-24 horas. Los cultivos se subcultivan cuando alcanzan aproximadamente 2.5-3.5 x 10^6 células/mL y se diluyen hasta cerca de 1 x 10^6 células/mL, y las infecciones se realizan sobre células sanas en fase exponencial con una viabilidad superior al 95%.
→Células DF-1, fibroblastos de embrión de pollo
DF-1 (UMNSAH/DF-1, ATCC CRL-12203) es una línea de fibroblastos de embrión de pollo inmortalizada de forma espontánea, derivada de embriones de la línea East Lansing Line 0, una línea de pollo libre de loci del virus de la leucosis aviar endógeno. Como no porta retrovirus endógenos y se inmortalizó sin transformación viral ni química, es el sustituto continuo estándar de los fibroblastos primarios de embrión de pollo en virología aviar, desarrollo de vacunas y producción de virus recombinantes. Las células DF-1 se cultivan en DMEM con alta glucosa y 10% de suero fetal bovino a 37 C y 5% CO2, crecen más rápido que los CEF primarios, se transfectan con eficiencia y sostienen la replicación de la influenza aviar, el virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa, los virus de la leucosis y el sarcoma aviares y muchos otros patógenos aviares con títulos iguales o superiores a los de los CEF.
→Protocols and methods
Recuento de células con hemocitómetro
Un hemocitómetro es un portaobjetos de vidrio grueso con una cuadrícula grabada con precisión sobre la que un cubreobjetos crea una cámara de exactamente 0,1 mm de profundidad, de modo que un volumen conocido de suspensión celular puede contarse al microscopio y convertirse en una concentración. Para células de mamífero se cuentan los cuatro cuadros de las esquinas de 1 mm2, se calcula la media, se multiplica por el factor de dilución y se multiplica por 10^4 para obtener células por mL, porque cada cuadro de esquina encierra exactamente 10^-4 mL. Mezclar la muestra 1:1 con azul de tripano al 0,4% antes de cargar la cámara permite obtener el porcentaje de viabilidad a partir del mismo recuento, ya que solo las células muertas, con la membrana comprometida, captan el colorante.
→Inactivación por calor del suero fetal bovino (FBS)
La inactivación por calor del suero fetal bovino es una incubación controlada de 30 minutos a 56 grados C que destruye las proteínas termolábiles de la cascada del complemento antes de añadir el suero al medio de cultivo. El suero se descongela, se atempera a 37 grados C, se traslada a un baño a 56 grados C, se mantiene exactamente 30 minutos contados desde el momento en que el propio suero alcanza la temperatura, con agitación suave cada 5-10 minutos, y después se enfría de inmediato y se reparte en alícuotas. Para el cultivo rutinario de líneas celulares establecidas suele ser innecesaria, porque la actividad del complemento en el suero fetal es baja y el calentamiento degrada además factores de crecimiento lábiles; sigue siendo práctica habitual en los ensayos inmunológicos y con células sensibles al complemento.
→Subcultivo celular (pase)
El subcultivo celular, también llamado pase, es el traspaso de las células de un cultivo que se aproxima a la confluencia a recipientes nuevos con medio fresco para que el crecimiento pueda continuar. Las células adherentes se despegan primero, normalmente con Trypsin-EDTA al 0.25% o al 0.05% o con un reactivo de disociación no enzimático, y se vuelven a sembrar a una densidad menor fijada por una proporción de división como 1:4; las células en suspensión simplemente se diluyen en medio fresco sin ningún paso de disociación. La mayoría de las líneas celulares adherentes continuas se subcultivan al 70-80% de confluencia, lo que suele significar dos o tres pases por semana.
→Medio de congelación celular y protocolos de criopreservación
El medio de congelación celular es una disolución con crioprotector que permite a las células sobrevivir a la congelación y al almacenamiento prolongado; lo más habitual es prepararlo con un medio basal o suero más un 5-10 % de dimetilsulfóxido (DMSO), siendo el 10 % el punto de partida estándar. El DMSO penetra en la célula y modifica la forma en que se congela el agua, evitando los cristales de hielo intracelulares que de otro modo romperían las membranas durante el enfriamiento. Las células se congelan a una velocidad controlada de aproximadamente 1 C por minuto hasta -80 C y después se trasladan a la fase de vapor del nitrógeno líquido, ya que el almacenamiento prolongado exige temperaturas por debajo de unos -135 C para impedir la recristalización del hielo. La descongelación es lo contrario: lo más rápida posible en un baño de agua a 37 C, seguida de una dilución inmediata para eliminar el DMSO, que resulta tóxico para las células por encima de las temperaturas de congelación.
→Recubrimiento con poly-L-lysine para cultivo celular
El recubrimiento con poly-L-lysine cubre la superficie de cultivo con un polímero sintético de carga positiva que se une a la membrana plasmática, cargada negativamente, y permite que las células poco adherentes se fijen al vidrio o al plástico. El protocolo estándar aplica una disolución estéril al 0.01% (0.1 mg/mL) a razón de aproximadamente 1 mL por cada 25 cm2, la deja en contacto con la superficie de 5 minutos a 1 hora a temperatura ambiente, la aspira, enjuaga a fondo con agua estéril de grado cultivo celular y seca la superficie al aire durante al menos 2 horas antes de sembrar las células. La adhesión que proporciona es puramente electrostática: la poly-L-lysine no activa las integrinas, de modo que las células que necesitan una señal real de la matriz extracelular requieren laminina, fibronectina o colágeno en su lugar o por encima de ella.
→Comparisons
PBS frente a DPBS: en qué se diferencian y cuál conviene usar
El PBS y el DPBS son ambos soluciones salinas tamponadas con fosfato; la diferencia está en la fórmula, no en la función. La formulación de Dulbecco (DPBS) añade cloruro de potasio y contiene aproximadamente el doble de fosfato que un PBS típico (unos 9.5 mM frente a unos 4 mM), y se comercializa en dos versiones: con calcio y magnesio, y sin ellos. En la práctica, la elección entre llevar o no cationes divalentes importa mucho más que la etiqueta PBS o DPBS: use una solución sin calcio ni magnesio para lavar las células antes de la tripsinización o de la disociación con EDTA, porque el Ca2+ y el Mg2+ sostienen precisamente los enlaces de cadherinas e integrinas que va a romper, y use la versión con calcio y magnesio cuando las células deban permanecer adheridas e intactas durante el lavado.
→EMEM frente a DMEM: qué cambió realmente la modificación
El EMEM (medio mínimo esencial de Eagle, vendido también como MEM) y el DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) son el mismo medio con una generación de diferencia: el DMEM es la formulación de Eagle enriquecida, con aproximadamente cuatro veces más vitaminas, alrededor del doble de la mayoría de los aminoácidos, el doble de glutamina, glicina y serina añadidas, nitrato férrico y 3.7 g/L de bicarbonato de sodio frente a los 1.5-2.2 g/L del EMEM. La consecuencia práctica es que el DMEM sostiene líneas de crecimiento rápido y alta demanda metabólica, como HEK293 y NIH/3T3, mientras que el EMEM se adapta mejor a células adherentes más lentas y menos exigentes y a líneas primarias; y como el bicarbonato más alto del DMEM está formulado para un 10% de CO2 y el del EMEM para un 5%, ambos medios no son intercambiables sin comprobar antes el incubador.
→Tripsina frente a Accutase: cómo elegir un reactivo de disociación celular
La tripsina es una serina proteasa pancreática que corta los enlaces peptídicos después de lisina y arginina; despega las células deprisa, pero sin discriminar: hay que detenerla con suero o con un inhibidor de tripsina, y corta las proteínas de superficie junto con los contactos de adhesión. Accutase es una mezcla propietaria de enzimas proteolíticas y colagenolíticas de origen invertebrado, suministrada en DPBS sin calcio ni magnesio con 0.5 mM de EDTA; actúa de forma más lenta y suave, no requiere paso de neutralización y conserva más epítopos de superficie. Elija tripsina para el subcultivo rutinario de líneas adherentes robustas, cuando importa la velocidad y las células vuelven directamente al cultivo; elija Accutase cuando las células recogidas son el experimento: citometría de flujo sobre marcadores de superficie, células madre pluripotentes, neuronas primarias o cualquier suspensión de células individuales en la que la viabilidad y el fenotipo deban sobrevivir a la recogida.
→Contamination and quality control
Contaminación en el cultivo celular
La contaminación del cultivo celular se agrupa en seis categorías: bacterias, levaduras, hongos filamentosos y mohos, micoplasma, virus y contaminación cruzada con otra línea celular. Las bacterias, las levaduras y los hongos se manifiestan en un plazo de uno a cinco días mediante turbidez, un cambio de pH o partículas visibles al microscopio, y se resuelven descartando el cultivo y localizando el fallo de técnica que permitió su entrada. El micoplasma, la contaminación viral y la identificación errónea de la línea celular no producen ningún cambio visible y solo se detectan mediante ensayos: PCR o tinción de ADN para el micoplasma, y perfil de STR para la identidad. La respuesta correcta ante cualquier contaminación biológica confirmada es descartar el cultivo afectado, descontaminar el incubador y reiniciar a partir de un vial congelado limpio.
→Ensayo de endotoxinas en el cultivo celular
El ensayo de endotoxinas mide el lipopolisacárido bacteriano (LPS) presente en el agua de laboratorio, los medios, los sueros y los reactivos, y se expresa en unidades de endotoxina por mililitro (EU/mL), donde 1 EU equivale aproximadamente a 0.1–0.2 ng de la endotoxina de E. coli del estándar de referencia. Los métodos oficiales son el ensayo LAL (lisado de amebocitos de Limulus) en sus formatos de gelificación, turbidimétrico y cromogénico, recogidos en el capítulo USP <85>, y el ensayo con Factor C recombinante (rFC), libre de origen animal, recogido en USP <86>; los formatos cinéticos cuantifican hasta cerca de 0.001–0.005 EU/mL. Los límites prácticos en cultivo celular son 0.25 EU/mL para el agua, ≤1 EU/mL para la mayoría de los reactivos de grado cultivo celular y ≤10 EU/mL como estándar general del sector para el suero fetal bovino, con grados de baja endotoxina a ≤1 EU/mL y grados de endotoxina ultrabaja por debajo de 0.1 EU/mL. La endotoxina sobrevive al autoclave y atraviesa los filtros de 0.2 µm, de modo que hay que excluirla en el origen en lugar de intentar eliminarla después.
→Antibióticos de selección para líneas celulares de mamífero
Los antibióticos de selección son agentes citotóxicos que se utilizan para aislar células de mamífero portadoras de un gen de resistencia cotransfectado, matando a todas las que no lo llevan. Los cinco agentes estándar son G418/Geneticina (100–2000 µg/mL, gen de resistencia neo), higromicina B (50–1000 µg/mL, hph), blasticidina S (1–20 µg/mL, bsd o bsr), zeocina (50–1000 µg/mL, Sh ble) y puromicina (0.5–10 µg/mL, pac). La concentración correcta no es la que figura en la ficha técnica, sino la que se determina de forma empírica para cada línea celular mediante una curva de mortalidad: la concentración más baja que mata al 100% de las células no transfectadas dentro de la ventana de selección normal del agente, que es de 2–4 días para la puromicina y de hasta 14 días para el G418.
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