Células DF-1, fibroblastos de embrión de pollo

DF-1, formalmente UMNSAH/DF-1 y depositada como ATCC CRL-12203, se estableció a partir de fibroblastos de embrión de pollo de la línea East Lansing Line 0 (EV-0). La elección de esa línea de origen es el dato más importante de toda la línea celular.

La mayoría de los genomas de pollo contienen loci provirales endógenos del virus de la leucosis aviar (ev) -- secuencias retrovirales integradas en la línea germinal que pueden expresarse y producir proteínas y partículas virales. Para la mayoría de los usos esto es irrelevante, pero en la investigación de retrovirus aviares y en la fabricación de vacunas supone un factor de confusión serio: un ensayo para el virus de la leucosis aviar exógeno no puede distinguir con claridad un virus entrante de uno endógeno, y un sustrato vacunal que expresa secuencias retrovirales endógenas plantea un problema regulatorio. East Lansing Line 0 está libre de loci ev, de modo que DF-1 hereda esa condición. Se describe como la única línea celular aviar inmortalizada de forma espontánea, de disponibilidad inmediata y libre de virus endógenos.

La inmortalización fue espontánea. Se mantuvieron fibroblastos primarios de embrión de pollo en cultivo a través de la crisis y la senescencia, y emergió una población que siguió dividiéndose de forma indefinida. No se introdujo ningún oncogén, no se empleó ningún virus y no se aplicó ningún carcinógeno químico. Esto importa porque las líneas transformadas por virus arrastran las secuencias del agente transformante a cada experimento.

Qué sustenta la inmortalización. La caracterización publicada atribuye el fenotipo inmortal a una expresión alterada de reguladores del ciclo celular y de la muerte celular, en particular p53 y E2F-1 disfuncionales, junto con cambios en la expresión de genes antioxidantes. DF-1 no es, por tanto, un fibroblasto diploide normal en cuanto a su control del crecimiento, aunque tampoco sea una línea transformada por virus. No debería utilizarse como modelo del comportamiento del ciclo celular de un fibroblasto primario normal sin reconocer este punto.

Morfología y crecimiento. Las células DF-1 son fibroblastos adherentes de forma fusiforme que forman una monocapa con el aspecto característico de matrices paralelas propio de los cultivos de fibroblastos en confluencia. Crecen bastante más rápido que los CEF primarios y se transfectan con eficiencia, dos ventajas prácticas para el trabajo rutinario.

Medio estándar. Medio de Eagle modificado por Dulbecco con alta glucosa suplementado con 10% de suero fetal bovino, a 37 C y 5% CO2. Esta es la condición empleada en la mayor parte del trabajo publicado con DF-1 y es un valor por defecto razonable.

Sobre la temperatura. La temperatura corporal del pollo ronda los 41 C, y algunos protocolos de virología aviar cultivan DF-1 o propagan determinados virus a 38.5-39 C para representar mejor las condiciones del hospedador. DF-1 tolera ese intervalo. Salvo que su virus o su ensayo concreto exijan la temperatura elevada, 37 C es lo estándar y resulta directamente comparable con el grueso de la bibliografía. Sea cual sea la elección, manténgala constante a lo largo del experimento e indíquela en la sección de métodos, porque la cinética de replicación de algunos virus aviares difiere de forma apreciable entre 37 C y 39 C.

Suplementos. Algunos protocolos añaden entre 2 y 10% de suero de pollo junto a una parte del FBS o en su sustitución, y otros añaden caldo de triptosa fosfato; ambas prácticas se heredaron del trabajo con CEF primarios. Ninguna es necesaria para el crecimiento rutinario de DF-1.

Subcultivo. DF-1 es una línea adherente estándar y se pasa de forma convencional: lavar con PBS o DPBS sin calcio ni magnesio, despegar con Trypsin-EDTA, neutralizar con medio con suero o con un inhibidor de tripsina definido, y volver a sembrar. Proporciones de división de 1:3 a 1:8 dos veces por semana se ajustan a la mayoría de los calendarios de laboratorio.

No deje que los cultivos crezcan en exceso. Los fibroblastos mantenidos en confluencia durante periodos prolongados cambian su comportamiento, y los cultivos de DF-1 que se han dejado repetidamente en sobrecrecimiento denso pierden eficiencia de transfección y sostienen peor la replicación viral. Realice el pase antes de que la monocapa quede densamente compactada.

Número de pase. Incluso una línea inmortalizada deriva. Establezca pronto un banco de trabajo, registre el número de pase y vuelva al stock congelado en lugar de arrastrar un cultivo de forma indefinida. En cualquier trabajo en el que el título viral sea la lectura, mantenga constante la ventana de pases, ya que los títulos obtenidos en células de pase alto y de pase bajo no siempre son comparables.

Criopreservación. DF-1 se congela y se recupera bien en condiciones estándar: un medio de congelación con suero o definido con DMSO como crioprotector, enfriamiento a velocidad controlada de aproximadamente 1 C por minuto hasta -80 C y transferencia posterior a la fase de vapor de nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo.

La formulación por defecto de DMEM con 10% de FBS funciona, pero para cualquier proyecto orientado a la fabricación es el punto de partida equivocado, y existen medios sin suero específicos para DF-1 por buenas razones.

Por qué abandonar el suero en esta línea celular en particular:

• Fabricación de vacunas y biológicos. DF-1 se usa como sustrato para la producción de vacunas aviares y para la fabricación de virus recombinantes. Eliminar una materia prima de origen bovino suprime una vía de entrada de agentes adventicios y simplifica tanto el expediente regulatorio como la cadena de suministro. Este es el motor dominante.
• Purificación del virus. El suero aporta un fondo proteico amplio y variable que hay que separar del virus aguas abajo. Una cosecha sin suero es mucho más fácil de clarificar y purificar, sobre todo para un producto que pasará por un gradiente de densidad o por una columna de cromatografía.
• Consistencia del título. El título viral es sensible al estado fisiológico de la célula hospedadora, y la variación entre lotes de suero se traslada directamente a la variación del título. Retirar el suero elimina una entrada no controlada de una medida que ya es de por sí ruidosa.
• Economía de escala. Por encima de la escala de banco, el suero es una partida de coste importante y un riesgo de aprovisionamiento.

Las formulaciones para DF-1 suelen ser libres de origen animal, tamponadas para operar en suspensión o en adherencia según el proceso, y se suministran con L-glutamina o con el dipéptido más estable L-alanil-L-glutamina, lo que merece mención: la glutamina se degrada en disolución a amoníaco, que es tóxico y se acumula, y la forma dipeptídica reduce esto de forma sustancial. Existen formatos en polvo para el escalado, allí donde preparar el medio en la propia instalación resulta más económico que transportar líquido.

Adaptación. Traslade las células de forma gradual en lugar de en un solo paso: reduzca el suero por etapas a lo largo de varios pases, permitiendo que la velocidad de crecimiento y la viabilidad se recuperen en cada etapa antes de continuar. Cree un banco antes de empezar por si la adaptación fracasa, y banquee la línea adaptada en cuanto sea estable. Cuente con necesitar un inhibidor de tripsina definido o un reactivo de disociación recombinante para el subcultivo, ya que sin suero no hay inhibidores de proteasas que detengan la tripsinización. Las células adherentes que pierden el suero pierden también fibronectina y vitronectina, por lo que puede hacer falta una superficie recubierta.

Revalide tras la adaptación. Confirme que la replicación y el título virales en el sistema sin suero coinciden con los obtenidos con suero antes de confiar en el nuevo proceso. Las células pueden crecer perfectamente en un medio nuevo y, aun así, sostener la replicación viral de otro modo.

Sustitución de los fibroblastos primarios de embrión de pollo. Los CEF primarios se preparan disociando embriones de huevos libres de patógenos específicos, y arrastran problemas prácticos persistentes: exigen un suministro fiable de huevos SPF, requieren mucha mano de obra, tienen una vida útil finita, de modo que hay que preparar células repetidamente, y -- el punto que más se menciona en la bibliografía -- los títulos virales fluctúan de un lote a otro. DF-1 elimina todo esto. Está disponible de forma continua, se comporta de manera consistente entre preparaciones y su fondo genético es fijo.

Trabajo con virus de la leucosis y el sarcoma aviares. Esta es la aplicación para la que se creó el fondo libre de ev de la línea. DF-1 se ha adoptado como sustituto de los CEF primarios en la detección de virus de la leucosis aviar, donde la ausencia de provirus endógeno significa que la señal del ensayo refleja de forma inequívoca virus exógeno. También soporta ALV-J, un subgrupo que crece mal en algunos otros sistemas. En relación con esto, DF-1 es el hospedador estándar de los vectores retrovirales basados en RCAS, el sistema vectorial aviar derivado de ALV que se emplea para la transferencia génica en biología aviar y del desarrollo.

Propagación viral en general. DF-1 soporta la replicación de un amplio abanico de virus aviares, entre ellos el virus de la influenza aviar (aislados tanto de baja como de alta patogenicidad), el virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa, los reovirus aviares, el virus de la enfermedad de Newcastle, el virus de la enfermedad de Marek y la viruela aviar. Para varios de ellos, la replicación es comparable o superior a la observada en CEF primarios.

Desarrollo y fabricación de vacunas. DF-1 se ha evaluado directamente frente a preparaciones basadas en CEF como sustrato para vacunas aviares, incluidos estudios comparativos de seguridad, inmunogenicidad y eficacia de vacunas contra la enfermedad infecciosa de la bolsa en pollos libres de patógenos específicos. Un sustrato continuo, caracterizado y libre de virus endógenos es bastante más fácil de cualificar y controlar que una célula primaria preparada de nuevo a partir de huevos cada vez.

Producción de proteínas y virus recombinantes. La alta eficiencia de transfección y el crecimiento rápido hacen de DF-1 una herramienta útil para producir virus aviares recombinantes y para expresar proteínas aviares en un hospedador homólogo, donde importan el plegamiento correcto y las modificaciones postraduccionales propias de las aves.

DF-1 sostiene bien la replicación viral, y parte de la razón es que su respuesta antiviral innata está atenuada en comparación con la de los CEF primarios. Esto es a la vez la ventaja práctica de la línea y una limitación que hay que entender antes de usarla en inmunología.

Trabajos publicados han demostrado que las células DF-1 presentan un nivel constitutivamente elevado de SOCS1 de pollo -- supresor de la señalización de citocinas 1, un regulador negativo de la señalización de citocinas -- descrito en torno a una expresión basal 16 veces mayor que en los CEF primarios, y que esto suprime las respuestas innatas en la línea. Estudios comparativos de la expresión de genes de la inmunidad innata tras la infección con influenza aviar H5N1 altamente patógena y H9N2 de baja patogenicidad han caracterizado en detalle estas respuestas en DF-1.

Qué se deriva de ello en la práctica:

• Para propagar virus, es una ventaja. Un hospedador con una respuesta de interferón amortiguada permite una replicación más alta y títulos más reproducibles. Parte de la fama de DF-1 de igualar o superar los títulos de los CEF se debe a esto, más que a una permisividad superior como tal.
• Para estudiar la inmunidad innata, es un factor de confusión serio. Los resultados sobre inducción de interferón, señalización de citocinas y expresión de genes antivirales obtenidos en DF-1 no se trasladan sin más a los CEF primarios ni al animal. Este tipo de trabajo debería confirmarse en células primarias, y los artículos deberían indicar qué sistema se usó y por qué.
• Para los estudios de interacción hospedador-patógeno en general, recuerde además la función alterada de p53 y E2F-1 señalada antes. DF-1 es un excelente hospedador de producción y propagación y un modelo comprometido de la fisiología normal del fibroblasto.

Nada de esto es un argumento en contra de usar DF-1. Es un argumento a favor de ajustar el sistema a la pregunta, que es el mismo argumento aplicable a toda línea inmortalizada y que simplemente está documentado con una claridad poco habitual en este caso.

Procedencia. Obtenga DF-1 de un banco celular establecido y con trazabilidad documentada, no mediante una transferencia sin documentar de laboratorio a laboratorio. Aquí la procedencia importa más de lo habitual, porque la propiedad que define a la línea -- estar libre de retrovirus endógenos -- es exactamente el tipo de cosa que no puede verificarse mirando las células.

Autentique y analice. Confirme la identidad al recibirlas y realice una detección de micoplasmas antes de crear el banco. El micoplasma altera la replicación y el título virales, lo que en un hospedador de propagación viral es una amenaza directa para la lectura principal.

Cree bancos correctamente. Establezca un banco maestro a pase bajo y, a partir de él, un banco de trabajo, y trabaje siempre desde el banco de trabajo. Es una práctica estándar para cualquier línea, pero resulta especialmente valiosa en una línea cuyo valor reside en la consistencia entre preparaciones.

Mantenga constante la ventana de pases en el trabajo crítico en título, y registre el número de pase junto a los datos de título.

Vigile el medio. La glutamina se degrada en disolución y genera amoníaco; utilice un lote de medio fresco o una fuente de glutamina dipeptídica estabilizada para las infecciones largas, en las que el amoníaco acumulado puede afectar tanto a las células como al rendimiento viral.

Bioseguridad. DF-1 en sí requiere una contención estándar de cultivo celular. El nivel de contención de cualquier trabajo concreto lo determina el virus que se propaga, no la línea celular: la influenza aviar altamente patógena y otros agentes conllevan requisitos propios, bastante más altos, y sus propias autorizaciones regulatorias. Confirme la contención y la autorización aplicables antes de iniciar cualquier trabajo de propagación.