Recuento de células con hemocitómetro

El hemocitómetro que se utiliza en cultivo celular es casi siempre del modelo Neubauer mejorado. Es un portaobjetos de vidrio grueso con dos plataformas de recuento pulidas, cada una con una cuadrícula rayada idéntica, separadas por canales. Unos resaltes elevados a ambos lados mantienen el cubreobjetos exactamente 0,1 mm por encima de la superficie rayada, y esa profundidad fija es lo que convierte un recuento bidimensional en una medida de volumen.

El área rayada mide 3 mm x 3 mm = 9 mm2 y está dividida en nueve cuadros de 1 mm x 1 mm:

• Los cuatro cuadros de las esquinas están subdivididos cada uno en 16 cuadros de 0,25 x 0,25 mm. Son los que se usan para el recuento de células de mamífero.
• El cuadro central está subdividido en 25 cuadros medianos de 0,2 x 0,2 mm, cada uno de los cuales se divide a su vez en 16 cuadros pequeños de 0,05 x 0,05 mm, es decir, 400 cuadros pequeños en total. Este rayado más fino está pensado para partículas pequeñas y numerosas, como los eritrocitos y las plaquetas.

Los volúmenes se deducen directamente del área x 0,1 mm de profundidad:

La cifra de 1 x 10^-4 mL es el origen del célebre factor x 10^4. El recuento de células de un cuadro de esquina es un recuento en una diezmilésima de mililitro, de modo que multiplicar por 10 000 lo convierte en células por mL. El factor no tiene más misterio, y cambia si se cuenta en una cámara de profundidad distinta: algunas cámaras desechables tienen 0,02 mm o 0,1 mm de profundidad y llevan un multiplicador diferente, indicado en el envase.

En la Neubauer mejorada, los límites de los cuadros de 1 mm2 están trazados como líneas triples. La línea central de la triple es el límite a efectos del recuento. Es una fuente frecuente de error silencioso: contar hasta la línea exterior aumenta el área, y por tanto el recuento, en un pequeño porcentaje.

1. Limpie la cámara y el cubreobjetos con etanol al 70% y séquelos con un paño sin pelusa. Utilice el cubreobjetos grueso y esmerilado que se suministra con el hemocitómetro, no un cubreobjetos de microscopía corriente: uno corriente se comba y la profundidad de la cámara deja de ser de 0,1 mm.
2. Asiente el cubreobjetos. Humedezca muy ligeramente los resaltes con el vaho del aliento y presione con firmeza el cubreobjetos. Cuando queda bien asentado aparecen los anillos de Newton —franjas de interferencia tenues— donde el vidrio contacta con el vidrio. Su presencia es la única confirmación fiable de que la profundidad de la cámara es correcta.
3. Obtenga una verdadera suspensión de células individuales. Los agregados hacen que el recuento carezca de sentido. Tripsinice lo suficiente, pipetee con suavidad para dispersar y pase la suspensión por un filtro celular si la línea tiende a agregarse.
4. Mezcle justo antes de tomar la muestra. Las células sedimentan en un minuto. Pipetee arriba y abajo o invierta el tubo varias veces y tome la alícuota de inmediato, a media altura.
5. Diluya con azul de tripano. Lo estándar es una mezcla 1:1: por ejemplo, 50 microlitros de suspensión celular más 50 microlitros de azul de tripano al 0,4%, lo que da un factor de dilución de 2. Mezcle con suavidad y cuente en un plazo de 3-5 minutos: el azul de tripano es citotóxico y, si la mezcla reposa, las células viables empiezan a captar el colorante y la viabilidad se lee artificialmente baja.
6. Cargue la cámara. Tome unos 10 microlitros, apoye la punta de la pipeta en la muesca del borde del cubreobjetos y deje que la capilaridad arrastre la muestra. Llene cada cámara en un solo movimiento continuo.
7. Compruebe el llenado. El área rayada debe quedar cubierta de manera uniforme y sin burbujas. Si ha entrado líquido en los canales, el cubreobjetos se ha levantado de sus resaltes y la profundidad es incorrecta: limpie, seque y vuelva a cargar. Un llenado insuficiente deja zonas secas y sesga el recuento en sentido contrario.
8. Deje sedimentar las células alrededor de 1 minuto antes de contar, para que queden en un mismo plano focal.

Para células de mamífero en cultivo, cuente los cuatro cuadros de esquina de 1 mm2. Algunos laboratorios añaden el cuadro central y cuentan cinco. Ambos criterios son válidos; lo que no es válido es alternar entre ellos, porque dan estadísticas de muestreo diferentes.

La regla de las líneas límite existe porque, de lo contrario, una célula situada sobre una línea se contaría dos veces, una en cada cuadro contiguo, o se omitiría por completo. La regla es sencilla:

Cuente las células que tocan dos lados contiguos del cuadro —formando una «L»— y excluya las que tocan los otros dos.

El criterio más habitual es incluir las líneas superior e izquierda y excluir la inferior y la derecha; el criterio simétrico, incluyendo la superior y la derecha, es igual de correcto. Elija uno, recójalo por escrito en su procedimiento normalizado y aplíquelo de forma idéntica en cada cuadro y por parte de cada operador. Una célula se juzga según dónde quede la mayor parte de su cuerpo respecto a la línea central del rayado triple.

En la práctica importan otras dos reglas:

• Ambas cámaras. Cargue y cuente los dos lados del portaobjetos. Los dos recuentos deberían coincidir dentro de aproximadamente un 10%. Si no lo hacen, la suspensión no se mezcló bien, la cámara se llenó de forma desigual o las células se están agregando: vuelva a cargar en lugar de promediar un par de valores defectuosos.
• Ventana de densidad. Busque aproximadamente entre 25 y 100 células por cuadro de esquina de 1 mm2, lo que corresponde a una suspensión de unas 2,5 x 10^5 a 1 x 10^6 células/mL tras la dilución. Por debajo de unas 25 por cuadro, el recuento queda dominado por el ruido de muestreo; por encima de unas 100, las células se solapan y se cuentan sistemáticamente de menos. Si la suspensión es demasiado densa, dilúyala más y registre el factor adicional.

El límite de precisión es estadístico, no humano. El recuento celular sigue la estadística de Poisson, de modo que el coeficiente de variación es aproximadamente 1/raíz(N), siendo N el número total de células contadas. Contar 100 células da un CV de alrededor del 10%; contar 200 da alrededor del 7%; contar 400 da alrededor del 5%. Ningún cuidado aplicado a un único cuadro con 30 células superará este límite: la única vía hacia un recuento más ajustado es contar más células.

La fórmula es:

Células/mL = (total de células contadas / número de cuadros contados) x factor de dilución x 10^4

El factor de dilución es el volumen total dividido entre el volumen de suspensión celular que contiene. Una mezcla 1:1 con azul de tripano supone un factor de dilución de 2, no de 1. Este es el error aritmético más frecuente en el recuento celular.

Ejemplo resuelto. Un frasco T-75 de HeLa se ha tripsinizado y resuspendido en 10,0 mL de medio completo. Se mezclan 50 microlitros de esa suspensión con 50 microlitros de azul de tripano al 0,4% (FD = 2) y se cargan 10 microlitros. Los cuatro cuadros de esquina dan:

Concentración de células viables

84,0 x 2 x 10^4 = 1,68 x 10^6 células viables/mL

Concentración total (viables + muertas)

(84,0 + 4,5) x 2 x 10^4 = 1,77 x 10^6 células/mL

Total de células viables recolectadas

1,68 x 10^6 células/mL x 10,0 mL = 1,68 x 10^7 células viables

Viabilidad

336 / (336 + 18) x 100 = 94,9%

Observe que el factor de dilución se cancela en el cálculo de la viabilidad, por lo que no aparece en él. Observe también que contar 336 células da un CV de alrededor del 5,5%, de modo que la concentración se comunica correctamente como 1,7 x 10^6 células/mL; expresarla como 1,68 x 10^6 sugiere una precisión que el método no tiene.

Cada cuadro de esquina contenía entre 76 y 91 células, dentro de la ventana de 25-100, así que no hizo falta ninguna dilución adicional.

El azul de tripano es un colorante diazoico aniónico que no puede atravesar una membrana plasmática intacta. Las células con la membrana comprometida lo captan y aparecen claramente azules y a menudo hinchadas; las células viables lo excluyen y se ven brillantes y refringentes, con bordes nítidos. La disolución de trabajo estándar es al 0,4% (p/v) en solución salina o PBS.

Lo que se mide así es la integridad de la membrana, algo más restringido que la «viabilidad» en su sentido corriente. Una célula que ya ha entrado en apoptosis pero conserva la membrana intacta cuenta como viable con azul de tripano. Una célula dañada mecánicamente durante la tripsinización cuenta como muerta aunque la población de la que procede esté sana. La exclusión con azul de tripano es la herramienta adecuada para una comprobación rutinaria de la recolección y la herramienta equivocada para medir el resultado de un experimento de citotoxicidad, donde hace falta un ensayo específico de apoptosis o metabólico.

Aspectos prácticos:

• El tiempo importa. Cuente en un plazo de 3-5 minutos desde la mezcla. El azul de tripano es tóxico por sí mismo y una exposición prolongada mata células, lo que arrastra la cifra de viabilidad a la baja.
• Las proteínas interfieren. El azul de tripano se une a las proteínas del suero, lo que tiñe el fondo y dificulta la discriminación. Si el fondo aparece muy azul, lave las células y páselas a PBS antes de contar.
• Espere valores superiores al 90% en un cultivo sano en fase logarítmica recolectado con cuidado. Un resultado del 70-85% apunta a un exceso de tripsinización, un frasco con exceso de confluencia, un pipeteo brusco o un problema del cultivo que conviene investigar antes de usar las células.
• Los restos no son células muertas. Los fragmentos azules pequeños e irregulares son restos de membrana y no deben contarse. Cuente únicamente objetos con un tamaño y una forma verosímiles de célula.

El recuento solo sirve si se traduce de nuevo en un volumen que pipetear. Siguiendo con el ejemplo anterior, la suspensión está a 1,68 x 10^6 células viables/mL.

Tarea: sembrar una placa de 6 pocillos a 2 x 10^5 células por pocillo en 2 mL de medio.

1. Concentración deseada. 2 x 10^5 células en 2 mL = 1 x 10^5 células/mL.
2. Volumen total necesario. Seis pocillos x 2 mL = 12 mL. Prepare 13 mL para cubrir las pérdidas de pipeteo.
3. Células totales necesarias. 13 mL x 1 x 10^5 células/mL = 1,3 x 10^6 células.
4. Volumen de la suspensión madre. 1,3 x 10^6 / 1,68 x 10^6 células/mL = 0,774 mL = 774 microlitros.
5. Complete el volumen. Añada 774 microlitros de suspensión celular a 12,23 mL de medio completo precalentado, mezcle con suavidad y dispense 2 mL por pocillo.
6. Distribuya de manera uniforme. Mueva la placa de delante hacia atrás y después de lado a lado antes de introducirla en el incubador. Agitarla en círculo empuja las células hacia el centro de cada pocillo.

La misma aritmética rige todos los usos posteriores del recuento: la expansión en frascos a un número fijo de células/cm2, la criopreservación a un número fijo de células/mL por vial y la siembra de placas de ensayo. Mantenga la concentración en células/mL como número de trabajo y convierta una sola vez al final.

Agregados. El fallo más dañino, porque sesga el recuento sin parecer un error. Las células agregadas se cuentan de menos, las densidades de siembra salen bajas y los resultados no son reproducibles. Las causas son una tripsinización incompleta, el ADN liberado de células lisadas y una mezcla insuficiente. Se corrige alargando algo la disociación, añadiendo DNasa al medio de neutralización, pipeteando con suavidad para dispersar o filtrando la suspensión. No intente contar una suspensión con agregados: vuelva a prepararla.

Líquido en los canales. El cubreobjetos se ha levantado y la cámara ya no tiene 0,1 mm de profundidad, por lo que todos los valores obtenidos de ella son erróneos. Limpie, seque, vuelva a asentar el cubreobjetos hasta que aparezcan los anillos de Newton y cargue de nuevo.

Demasiado pocas células por cuadro. Por debajo de unas 25 por cuadro de esquina, el error de Poisson desborda la medición. Concentre la suspensión o cuente más cuadros y ajuste el divisor en consecuencia.

Demasiadas células por cuadro. Por encima de unas 100 por cuadro de esquina, las células se solapan y se cuentan de menos. Diluya e incorpore el factor adicional al cálculo. Los registros deben recoger toda la cadena de diluciones, no solo el último paso con azul de tripano.

Olvidar el factor de dilución del azul de tripano. Reduce a la mitad todos los resultados. Si una densidad de siembra sale exactamente la mitad o el doble de lo previsto, revise primero el factor de dilución.

Contar dos veces la misma cámara y llamarlo réplica. Volver a cargar y contar la misma cámara pone a prueba su vista, no la suspensión. Una réplica real significa las dos cámaras, a partir de una muestra recién mezclada.

Sedimentación de las células en el tubo durante un recuento largo. La alícuota cargada en segundo lugar está más diluida que la primera. Mezcle justo antes de cada carga.

Regla de límites incoherente entre operadores. Genera un desplazamiento sistemático entre personas que cuentan la misma suspensión, normalmente de varios puntos porcentuales. Deje el criterio por escrito.

Cámara sucia o rayada. Los restos depositados en el rayado se cuentan como células por unos ojos cansados y por algunos sistemas automáticos. Limpie con etanol y un paño sin pelusa, nunca con material abrasivo: el rayado está grabado y puede dañarse de forma permanente.

El hemocitómetro sobrevive porque es barato, necesita 10 microlitros, no requiere calibración y permite al operador ver la muestra. Este último punto no es menor: la agregación, los restos, la contaminación y una morfología inesperada son visibles durante un recuento manual e invisibles en una cifra devuelta por un instrumento.

Sus puntos débiles son el rendimiento y la dependencia del operador. Lleva varios minutos por muestra, y operadores distintos que apliquen criterios de límites distintos y juicios distintos sobre qué cuenta como célula discreparán más allá del error estadístico.

Los contadores automáticos basados en imagen aplican la misma química del azul de tripano en un portaobjetos desechable y siguen un algoritmo fijo, lo que elimina el sesgo del operador y requiere menos de un minuto por muestra. Son la opción adecuada para el recuento rutinario en volumen. Heredan los puntos ciegos del hemocitómetro —también cuentan mal los agregados— y necesitan validarse frente a un recuento manual para cada tipo celular nuevo, porque los criterios de tamaño y circularidad están fijados para células de mamífero típicas.

Los contadores por impedancia (principio Coulter) cuentan muchos miles de partículas por medición y ofrecen una precisión excelente en el número total de partículas, pero discriminan por tamaño, no por integridad de membrana, así que no dan ninguna cifra de viabilidad y cuentan como células los restos del tamaño adecuado.

La citometría de flujo con un colorante de viabilidad proporciona datos multiparamétricos célula a célula y permite distinguir poblaciones apoptóticas de necróticas. Requiere más muestra, más puesta a punto y más análisis, y las concentraciones absolutas exigen microesferas de recuento o un instrumento volumétrico. Recúrrase a ella cuando la pregunta se refiera al estado de las células y no simplemente a cuántas hay.