Recubrimiento con poly-L-lysine para cultivo celular

La poly-L-lysine es un homopolímero del aminoácido L-lisina. Al pH del cultivo, los grupos amino de sus cadenas laterales están protonados, lo que confiere a la molécula una fuerte carga neta positiva. Adsorbida sobre vidrio o sobre poliestireno tratado por plasma, convierte la superficie en una capa densamente catiónica. La membrana plasmática de una célula de mamífero tiene carga neta negativa, aportada por glicoproteínas y glicolípidos sialilados y por fosfolípidos aniónicos, de modo que la célula queda retenida en la superficie por simple atracción electrostática.

Ese mecanismo define a la vez la utilidad y los límites del recubrimiento.

Lo que aporta. Adhesión donde de otro modo no habría ninguna o muy poca, lograda de forma barata y reproducible, con un material químicamente definido y libre de origen animal que no presenta variabilidad biológica entre lotes. Funciona sobre vidrio, que por lo demás es un sustrato pobre para la mayoría de las células en cultivo, y por eso es el tratamiento por defecto de los cubreobjetos destinados a microscopía.

Lo que no aporta. Señalización. La unión de un ligando de la matriz extracelular a las integrinas desencadena el ensamblaje de adhesiones focales, la organización del citoesqueleto y las rutas posteriores de supervivencia y diferenciación. Una interacción de carga no desencadena nada de eso. Las células sobre poly-L-lysine sola se adhieren, pero muchas se extienden mal, y los tipos celulares que dependen de señales de supervivencia procedentes de la matriz —neuronas primarias, células endoteliales, muchas poblaciones madre y progenitoras— no prosperan sobre ella como sustrato único.

Por eso la disposición habitual en el cultivo neuronal es primero poly-L-lysine o poly-D-lysine y después laminina: la capa de polilisina inmoviliza la laminina y mejora su cobertura, y la laminina aporta la señal mediada por receptor.

La polilisina se vende en distintas fracciones de peso molecular, normalmente desde unos 30000 hasta más de 300000 Da, en forma de polvo liofilizado (habitualmente la sal bromhidrato) o de disolución estéril lista para usar.

El compromiso es sencillo. Las cadenas de peso molecular alto llevan más sitios de unión por molécula y se adsorben con más tenacidad, pero las disoluciones son más viscosas, más difíciles de pipetear de manera uniforme y más difíciles de enjuagar por completo. Las fracciones de peso molecular bajo se manejan y se enjuagan mejor, pero se unen con menos firmeza.

Los protocolos publicados se agrupan en dos zonas:

• Disoluciones al 0.01% (0.1 mg/mL) del intervalo de 70000-150000 para el recubrimiento rutinario de plástico de cultivo y de cubreobjetos. Es la concentración del protocolo de proveedor más extendido.
• De 0.1 a 1 mg/mL del intervalo de 30000-70000 en tampón borato 0.15 M, pH 8.3, para cubreobjetos de vidrio en cultivo neuronal primario, donde el tampón alcalino mejora la adsorción al vidrio.

Las disoluciones estériles al 0.01% listas para usar eliminan los pasos de pesada, disolución y filtración, y compensan su coste para quien las utiliza de forma ocasional. Si la prepara usted mismo, disuelva el polvo en agua estéril de grado cultivo celular, fíltrela por una membrana de 0.22 µm y conserve alícuotas congeladas; la disolución es estable congelada, pero los ciclos repetidos de congelación y descongelación la degradan. No autoclave las disoluciones de polilisina.

Trabaje en condiciones asépticas dentro de una cabina de bioseguridad durante todo el proceso. Los volúmenes que siguen corresponden al protocolo de proveedor estándar de 1.0 mL de disolución al 0.01% por cada 25 cm2 de superficie de crecimiento, lo que equivale aproximadamente a 5 µg de polilisina por cm2.

1. Prepare la disolución de trabajo. Diluya la disolución madre hasta el 0.01% (0.1 mg/mL) en agua estéril de grado cultivo celular. Como referencia, la formulación clásica son 5 mg de polilisina disueltos en 50 mL de agua estéril.
2. Dispense sobre la superficie. Añada 1.0 mL por cada 25 cm2 —aproximadamente 0.5 mL por pocillo en una placa de 24 pocillos, 1 mL por pocillo en una de 6 pocillos y 3 mL para un frasco T-75— y balancee el recipiente para que quede cubierta toda la superficie de crecimiento. La cobertura irregular en este paso es la causa más frecuente de una adhesión desigual más adelante.
3. Incube. Deje actuar a temperatura ambiente. Cinco minutos bastan en el protocolo estándar; muchos laboratorios emplean de 30 minutos a 1 hora, o toda la noche a 4 °C, sin perjuicio alguno. Prolongar la incubación no aumenta indefinidamente la capa adsorbida, porque la adsorción se satura.
4. Aspire la disolución por completo. No deje que se evapore en el recipiente: la evaporación deposita toda la carga de soluto como una costra en lugar de una monocapa.
5. Enjuague a fondo con agua estéril de grado cultivo celular. Este paso no es opcional y es el que más a menudo se descuida. La polilisina libre no adsorbida que queda en la superficie es citotóxica: permeabiliza las membranas a concentraciones muy inferiores a las utilizadas para el recubrimiento. Enjuague al menos tres veces, y más si el material es de peso molecular alto o si se trata de cultivos primarios sensibles.
6. Seque. Aspire el último enjuague y deje el recipiente abierto en la cabina con el flujo laminar en marcha hasta que la superficie esté completamente seca: al menos 2 horas. Las células se siembran sobre una superficie recubierta y seca.
7. Use o almacene. Los recipientes recubiertos pueden emplearse de inmediato o sellarse y guardarse en seco. Las placas recubiertas se conservan de semanas a meses si se almacenan secas, estériles y protegidas de la luz; valide el periodo de almacenamiento en sus propias condiciones en lugar de darlo por supuesto.

Nota sobre esterilidad: si la disolución de polilisina se esterilizó por filtración y el trabajo se hizo en cabina, no hace falta ninguna esterilización adicional. Cuando se recurre a la esterilización con luz ultravioleta de los cubreobjetos recubiertos, lo habitual son 10-15 minutos, pero una exposición ultravioleta prolongada daña el recubrimiento y el plástico.

El vidrio requiere más preparación que el plástico y las neuronas primarias perdonan menos, de modo que esta variante es más exigente.

1. Limpie los cubreobjetos. Haga un lavado ácido (habitualmente con ácido nítrico o clorhídrico), enjuague después exhaustivamente en agua destilada y luego en etanol, y esterilice por calor seco o en autoclave. Los cubreobjetos sin limpiar se recubren de forma irregular y las neuronas se desprenden en láminas durante los cambios de medio.
2. Prepare la polilisina en tampón borato. De 0.1 a 1 mg/mL de poly-L-lysine (PM 30000-70000) en tampón borato 0.15 M, pH 8.3. El tampón alcalino desprotona los silanoles de la superficie del vidrio y mejora la adsorción.
3. Cubra los cubreobjetos con la disolución: unos 120 µL por cubreobjetos de 12 mm bastan si se aplican en gota, o bien sumérjalos en una placa.
4. Incube al menos 30 minutos a temperatura ambiente, o toda la noche a 4 °C. Para el trabajo con neuronas, la incubación durante la noche es la opción más habitual.
5. Enjuague exhaustivamente. Para neuronas primarias, enjuague diez veces o más con agua destilada estéril. Se trata de un exceso de enjuague deliberado: la polilisina libre residual es la principal causa de mala supervivencia neuronal en las primeras 48 horas tras la siembra, y las neuronas son mucho más sensibles a ella que las líneas celulares.
6. Seque en la cabina y almacene en seco y en condiciones estériles.
7. Añada laminina si el protocolo lo exige. Aplique laminina a 5-50 µg/mL (habitualmente en torno a 10 µg/mL para neuronas) en PBS o en el medio base, 2 horas a 37 °C o toda la noche a 4 °C. No enjuague la laminina ni deje que se seque: aspire inmediatamente antes de sembrar y añada la suspensión celular a continuación. La laminina seca pierde actividad, y las superficies recubiertas con laminina se emplean mejor recién preparadas que almacenadas.

Ambos son polímeros enantioméricos del mismo aminoácido y son equivalentes desde el punto de vista químico y electrostático. La diferencia es biológica.

Las proteasas que secretan las células en cultivo cortan los enlaces peptídicos entre aminoácidos L y no cortan los enlaces entre aminoácidos D. Por tanto, la poly-L-lysine se degrada lentamente por acción de las células que crecen sobre ella; la poly-D-lysine no. De ahí se derivan dos consecuencias:

• La poly-D-lysine es preferible para el cultivo prolongado, en particular con neuronas y glía primarias mantenidas dos semanas o más, donde un sustrato que se degrada pierde adhesión de forma progresiva y libera oligómeros de lisina libres al medio.
• La poly-L-lysine es perfectamente adecuada para el trabajo de corta duración —fijar una línea celular para un experimento de 48 horas, inmovilizar células para microscopía o preparaciones por citocentrifugación— y cuesta menos.

La preocupación que se repite a menudo de que la degradación de la poly-L-lysine libere cantidades tóxicas de L-lisina libre merece formularse con cuidado: la degradación es real, pero en la mayoría de los cultivos fallidos el problema práctico no es la toxicidad de la lisina, sino la pérdida de adhesión con el tiempo unida a un enjuague insuficiente del polímero libre en el paso de recubrimiento. Si las neuronas mueren en los dos primeros días, sospeche del enjuague. Si un cultivo de dos semanas se despega en la segunda semana, sospeche del isómero L.

Cuando el cultivo es prolongado, las células son primarias o el experimento resulta caro, utilice poly-D-lysine. En los demás casos, la poly-L-lysine es una opción por defecto razonable.

La mayoría de las líneas celulares adherentes establecidas —HeLa, CHO-K1, Vero, la mayor parte de las líneas de fibroblastos— se adhieren perfectamente al poliestireno estándar tratado para cultivo celular, que ya está tratado por plasma para portar grupos carboxilo e hidroxilo con carga negativa y que adsorbe las proteínas de adhesión presentes en el suero del medio. Recubrir para estas líneas es trabajo innecesario y una variable innecesaria.

El recubrimiento sí es realmente necesario cuando:

• El sustrato es vidrio sin tratar o plástico sin tratar. Cubreobjetos para microscopía, portaobjetos con cámara, algunas placas de fondo óptico y dispositivos microfluídicos.
• Las células son poco adherentes. HEK293 es el ejemplo clásico: crece sobre plástico, pero se levanta en láminas durante los cambios de medio y los lavados, y un recubrimiento de polilisina resuelve en gran medida el problema.
• El cultivo es sin suero. Sin suero no hay proteínas de adhesión adsorbidas, de modo que la superficie tiene que aportar la adhesión por sí misma.
• Las células son primarias, neurales o poblaciones madre o progenitoras que requieren un sustrato adhesivo definido.
• El protocolo implica lavados repetidos —inmunocitoquímica, ensayos sobre la propia célula, microscopía con múltiples cambios de medio—, donde una adhesión marginal se traduce en pérdida de células.
• Se necesita una superficie definida y libre de origen animal por motivos regulatorios o de reproducibilidad, en los que el carácter sintético de la polilisina es una ventaja frente a las proteínas de matriz de origen animal.

El recubrimiento es la respuesta equivocada cuando el problema real es otro. Las células que no se adhieren porque se tripsinizaron en exceso, porque su viabilidad es baja, porque el medio no es el adecuado o porque el cultivo tiene micoplasma tampoco se adherirán a una superficie recubierta. Compruebe la viabilidad y el historial de pases antes de recurrir a un recubrimiento.

Cuando la carga por sí sola no basta, las alternativas son proteínas reales de la matriz extracelular que se unen a los receptores de tipo integrina.

La laminina es una glicoproteína heterotrimérica grande de la membrana basal y el sustrato principal para neuronas, progenitores neurales y muchas células endoteliales. Los protocolos publicados emplean 5-50 µg/mL, habitualmente en torno a 10 µg/mL para el trabajo con neuronas, en PBS o en el medio base, aplicados durante 2 horas a 37 °C o toda la noche a 4 °C. Los recubrimientos de laminina deben usarse recién preparados y no se debe dejar que se sequen; la disolución se aspira inmediatamente antes de sembrar y por lo general no se enjuaga. La laminina es sensible al calor, debe descongelarse lentamente a 4 °C y no debe volver a congelarse.

La fibronectina es una glicoproteína dimérica del plasma y de la matriz que porta el motivo RGD que reconocen varias integrinas. Es la opción habitual para fibroblastos, células endoteliales y células estromales mesenquimales. El recubrimiento típico ronda 1 µg/cm2, aplicado durante 1 hora a temperatura ambiente o toda la noche a 4 °C, seguido de tres enjuagues con agua estéril o PBS. Las mezclas comerciales de fibronectina y gelatina se aplican a 0.2-0.25 mL/cm2 durante 2-3 horas a temperatura ambiente, y después se aspiran y se lavan tres veces con PBS estéril.

El colágeno de tipo I es el sustrato estándar para hepatocitos, muchas células epiteliales y músculo liso. Se suministra solubilizado en ácido y se comporta como un gel que gelifica con el calor: los colágenos de tipo I y IV permanecen solubles a 4 °C, empiezan a solidificar a temperatura ambiente y gelifican rápidamente a 37 °C. Esa propiedad se aprovecha para preparar películas finas (capa delgada, secada al aire) o geles gruesos (dejados fraguar a 37 °C), que son sustratos biológicamente distintos. Neutralice la disolución y manténgala fría mientras la dispensa si desea un recubrimiento fino y uniforme.

La gelatina es colágeno desnaturalizado: barata, cómoda, esterilizable en autoclave y carente de la triple hélice intacta que confiere al colágeno nativo su capacidad de unión a integrinas. Es el recubrimiento económico estándar para células madre embrionarias sobre capas nutricias y para líneas de empaquetamiento retroviral. La cobertura superficial típica ronda 100-200 µg/cm2, que es lo que aporta una disolución al 0.1-0.2% a los volúmenes de trabajo normales.

Para todos ellos, los proveedores indican de forma explícita que la concentración de recubrimiento debe optimizarse para cada tipo celular concreto. Titule con al menos tres puntos sobre sus propias células antes de fijar un protocolo.

Las células se adhieren y luego mueren en 24-48 horas. Polilisina libre residual. Es el modo de fallo dominante en cultivo primario y se debe por completo al enjuague. Aumente de forma sustancial el número de enjuagues con agua —diez o más para neuronas— y confirme que la disolución de polilisina no se aplicó por encima del 0.01% en plástico.

Adhesión irregular, con células creciendo en islas y zonas desnudas entre ellas. Recubrimiento desigual. O bien la disolución no cubrió toda la superficie, o no se balanceó el recipiente, o la disolución se evaporó parcialmente durante una incubación larga en una cabina poco humidificada. Utilice volumen suficiente para cubrir por completo y balancee de forma deliberada.

Una película, costra o depósito cristalino visible en la superficie. Se dejó secar la disolución de recubrimiento en el recipiente en lugar de aspirarla y enjuagarla. Deseche el recipiente; un depósito seco no se puede recuperar.

Las células se redondean, se agrupan o no se extienden sobre una superficie recién recubierta. El recubrimiento está demasiado concentrado. El exceso de carga catiónica retiene las células con tanta fuerza que no pueden remodelar sus adhesiones ni extenderse. Diluya la disolución de recubrimiento y enjuague más.

El recubrimiento funciona en plástico pero no en vidrio. El vidrio necesita limpieza y se beneficia de la variante con tampón borato. Los cubreobjetos sin tratar y sin limpiar se recubren de forma irregular, sea cual sea la concentración.

Las células se despegan tras una o dos semanas en cultivo prolongado. Degradación proteolítica de la poly-L-lysine. Cambie a poly-D-lysine.

El recubrimiento con laminina no aporta ninguna mejora. Normalmente porque se dejó secar, se enjuagó, se guardó demasiado tiempo o se descongeló demasiado deprisa. Recubra en el momento, mantenga la superficie húmeda y aspire justo antes de sembrar.

Placas recubiertas que funcionaban el mes pasado ya no funcionan. Las superficies recubiertas no son indefinidamente estables, y la disolución madre de polilisina se degrada con los ciclos repetidos de congelación y descongelación. Reparta la disolución madre en alícuotas, feche las placas recubiertas y fije una vida útil validada en lugar de una supuesta.

Ningún recubrimiento sirve de nada. El problema no está en la superficie. Compruebe la viabilidad con azul de tripano, revise el número de pase, descarte micoplasma y compruebe que las células no se tripsinizaron en exceso en el último pase.