HBSS (solución salina equilibrada de Hank)

El HBSS es una solución salina equilibrada, no un medio de crecimiento. Aporta los iones inorgánicos que la célula necesita para mantener su equilibrio osmótico y su potencial de membrana, además de glucosa como fuente inmediata de energía, pero no contiene aminoácidos, ni vitaminas, ni proteínas. Las células sobreviven en él durante horas; no crecen en él.

La formulación se remonta a John Hanks, que desarrolló la mezcla de sales en la década de 1940; el artículo que suele citarse es el de Hanks y Wallace, 1949, sobre la conservación de tejidos mediante refrigeración. La intención del diseño se refleja en la composición: las sales de Hanks se concibieron para manipular y transportar tejido en condiciones atmosféricas normales, por lo que el bicarbonato es bajo y el fosfato realiza la mayor parte del efecto tampón.

Los usos habituales son:

• Lavado de células y monocapas antes de la tripsinización, la fijación o la lisis, para eliminar el suero y el medio residual
• Enjuague entre pasos de tinción o de ensayo
• Transporte y mantenimiento a corto plazo de tejido y aislados primarios
• Dilución de enzimas, reactivos y suspensiones celulares
• Tampón de ensayo para trabajos funcionales de corta duración, donde se desea glucosa pero no un medio completo

El HBSS es deliberadamente simple, y su simplicidad es la razón de que funcione: nada en él interfiere con un paso enzimático posterior ni con un ensayo de proteínas.

Formulación estándar de la solución salina equilibrada de Hanks:

* Se omiten en la versión sin calcio ni magnesio.

Dos características definen el comportamiento del HBSS.

El bicarbonato es muy bajo: 350 mg/L, frente a 2000 mg/L en RPMI 1640 y 3700 mg/L en DMEM. Las sales de Hanks se formularon para CO2 atmosférico. La mayor parte de la estabilidad del pH del HBSS procede del par de fosfatos (KH2PO4 y Na2HPO4), que ejerce su efecto tampón con independencia del CO2.

Contiene glucosa a 5.55 mM, a diferencia del PBS y el DPBS. Es una diferencia funcional real: las células mantenidas en HBSS disponen de una fuente de energía, lo que importa durante disociaciones largas, el transporte de tejido y los ensayos funcionales. También implica que el HBSS permite el crecimiento bacteriano si se contamina, de modo que debe tratarse con el mismo cuidado aséptico que un medio.

La osmolalidad total es próxima a la fisiológica, alrededor de 280–300 mOsm/kg, y el pH de trabajo es de aproximadamente 7.0–7.4.

Esta es la elección que más a menudo se hace mal, y la lógica resulta sencilla una vez enunciada.

Los cationes divalentes son necesarios para la adhesión celular. El calcio es esencial para las uniones célula–célula mediadas por cadherinas; el calcio y el magnesio juntos son necesarios para la adhesión al sustrato mediada por integrinas. Si se eliminan, la adhesión se debilita.

Use HBSS sin calcio ni magnesio cuando quiera que las células se desprendan. Este es el lavado que se aplica inmediatamente antes de la tripsina o de otro reactivo de disociación. Enjuagar una monocapa con HBSS sin Ca/Mg elimina el suero —que contiene inhibidores de proteasas capaces de reducir la acción de la tripsina— y además empieza a aflojar las uniones, de forma que la disociación posterior es más rápida y más suave. El HBSS sin Ca/Mg es también el diluyente correcto para los reactivos de disociación basados en EDTA, ya que el calcio del tampón simplemente quelaría el EDTA.

Use HBSS con calcio y magnesio cuando quiera que las células permanezcan adheridas y funcionales. Lavar una monocapa que se desea conservar, mantener un aislado primario, transportar tejido y cualquier ensayo funcional en el que importe la señalización: el calcio es un segundo mensajero, y un tampón sin calcio distorsionará las respuestas en ensayos de imagen, secreción y activación. Los cationes divalentes también son necesarios para muchas enzimas, entre ellas la colagenasa, por lo que las digestiones con colagenasa deben realizarse con la forma que contiene Ca/Mg.

Una regla práctica útil: si el paso siguiente implica una enzima o una medición funcional en células vivas, use la versión con Ca/Mg. Si el paso siguiente es el desprendimiento, use la versión sin Ca/Mg.

En la práctica, estas tres soluciones se usan casi indistintamente, y casi siempre eso está bien, aunque no siempre. La tabla comparativa de esta página ofrece la visión componente a componente; las distinciones prácticas son las siguientes.

Glucosa. El HBSS la tiene (5.55 mM); el PBS y el DPBS no. Si las células van a mantenerse más de unos pocos minutos, o se están disociando, transportando o midiendo funcionalmente, la glucosa del HBSS es una ventaja real. Para un enjuague de 30 segundos antes de la lisis no supone ninguna diferencia.

Capacidad tampón. El DPBS es el tampón simple más fuerte de los tres —su fosfato ronda los 8 mM totales, varias veces los aproximadamente 0.8 mM del HBSS— y mantiene bien el pH en la mesa de trabajo sin CO2. El HBSS depende de un tampón de fosfato más débil junto con una pequeña aportación de bicarbonato. En un incubador con 5% CO2, el bicarbonato del HBSS queda muy por debajo de lo necesario para sostener el pH, de modo que el HBSS no es adecuado para un uso prolongado en incubador.

Cationes divalentes. Las tres se suministran con y sin calcio y magnesio, y la misma lógica de selección se aplica a las tres.

Detalle iónico. El HBSS se aproxima más al perfil iónico de un medio: aporta magnesio en forma tanto de sulfato como de cloruro y tiene una carga de fosfato menor. El DPBS es una solución salina con un tampón de fosfato elevado. Ese fosfato elevado es un inconveniente en un caso concreto: el fosfato precipita el calcio, por lo que el DPBS con calcio puede formar fosfato de calcio insoluble tras un almacenamiento prolongado o después del autoclavado, y el fosfato interfiere con algunos ensayos sensibles al fosfato y con los estudios de mineralización.

Elección rápida: para enjuagar antes de la lisis o la fijación, cualquiera de las tres. Antes de la tripsinización, sin Ca/Mg —cualquiera de las tres, aunque por convención HBSS o DPBS—. Para transporte de tejido o disociaciones largas, HBSS con Ca/Mg por la glucosa. Para pasos largos en la mesa de trabajo sin CO2 y sin células que alimentar, DPBS por su mayor capacidad tampón. Para mineralización o ensayos sensibles al fosfato, HBSS antes que DPBS.

El HBSS está tamponado principalmente por su par de fosfatos, con una pequeña aportación de 4.17 mM de bicarbonato. El fosfato tampona bien en torno a pH 7.2 y es independiente del CO2, que es exactamente lo que necesita una solución de manipulación en la mesa de trabajo.

La consecuencia es que el HBSS no es una solución para incubador. En una atmósfera con 5% CO2, el CO2 disuelto acidifica la solución y 4 mM de bicarbonato no pueden contrarrestarlo. Las células dejadas en HBSS dentro de un incubador de CO2 quedan expuestas a un pH descendente, uno de esos errores que producen una pérdida de viabilidad lenta e inexplicada en lugar de un fallo evidente.

A la inversa, el HBSS que permanece en reposo a CO2 atmosférico pierde lentamente su escaso bicarbonato en forma de CO2 y deriva hacia la alcalinidad. En la práctica esto es menor y no importa en las escalas de tiempo en las que normalmente se usa el HBSS.

Si necesita una solución que mantenga el pH de forma fiable durante un procedimiento largo fuera del incubador, la respuesta habitual es HBSS tamponado con 10–25 mM de HEPES. El HEPES tampona bien a pH 7.2–7.4 sin CO2. Los inconvenientes son los de siempre: el HEPES genera peróxido de hidrógeno bajo la luz y resulta citotóxico para algunas células primarias a 25 mM.

Almacenamiento. El HBSS es estable a 2–8 °C, o a temperatura ambiente en algunas formulaciones; siga la etiqueta del proveedor. La caducidad sin abrir suele ser de 12–24 meses. Como contiene glucosa, permitirá el crecimiento microbiano si se contamina; trabaje de forma aséptica y no devuelva el líquido decantado al frasco original.

Temperatura. Para lavar células adherentes, use HBSS a temperatura ambiente o a 37 °C. Un tampón helado sobre una monocapa templada provoca choque por frío y puede desencadenar el desprendimiento o dañar la membrana. El HBSS frío es adecuado cuando se busca deliberadamente ralentizar el metabolismo —transporte de tejido, algunos aislamientos primarios—, pero eso es una decisión, no una opción por defecto.

No use el HBSS como medio de cultivo. No tiene aminoácidos, vitaminas, lípidos ni proteínas. Las células toleran unas pocas horas; pasar la noche en HBSS es un experimento de viabilidad, no un cultivo.

Errores frecuentes:

• Usar HBSS con Ca/Mg para enjuagar antes de la tripsinización. Los cationes divalentes mantienen la adhesión, la disociación tarda más y requiere más enzima, lo que aumenta el daño.
• Usar HBSS sin Ca/Mg como diluyente de colagenasa. La colagenasa requiere calcio; la digestión rendirá menos de lo debido.
• Diluir reactivos de disociación con EDTA en un tampón con Ca/Mg. El calcio consume el quelante.
• Dejar células en HBSS dentro de un incubador de CO2. Su bicarbonato no puede tamponar al 5% CO2 y el pH cae.
• Suponer que el HBSS y el PBS son equivalentes para ensayos funcionales. La glucosa y el distinto equilibrio iónico importan siempre que se mida a las células en lugar de simplemente enjuagarlas.
• Usar DPBS para trabajos de mineralización. Su elevado fosfato confunde el depósito de fosfato de calcio; el HBSS es la mejor opción.