Tampón de lisis ACK

El tampón de lisis ACK es químicamente sencillo. Tres solutos en agua, ajustados a pH fisiológico:

Tampón de lisis ACK 1X estándar, por litro

Filtre a través de una membrana de 0.22 micras. Consérvelo a 2-8 °C protegido de la luz, o a 15-30 °C en el caso de los productos suministrados para almacenamiento a temperatura ambiente; consulte la etiqueta, porque el ACK comercial se vende en ambas condiciones.

Las formulaciones comerciales varían ligeramente, y la variación es real. Las instrucciones de uso publicadas por Lonza especifican NH4Cl a 8024 mg/L, KHCO3 a 1001 mg/L y EDTA.Na2.2H2O a 3.722 mg/L, es decir, un contenido de EDTA diez veces menor que la cifra de 0.1 mM que aparece en la mayoría de las recetas publicadas. El ACK Lysing Buffer de Gibco se especifica a pH 7.0-7.7 con una osmolalidad de 280-320 mOsmol/kg, y el contenido de cloruro de amonio a menudo se indica como 155 mM en lugar de 150 mM. Ninguna de estas diferencias es lo bastante grande como para cambiar el comportamiento práctico del tampón, pero si va a reproducir exactamente un método publicado, use la receta que empleó ese método en lugar de suponer que todos los ACK son idénticos.

El EDTA es el componente por el que más se pregunta. Está presente a una concentración quelante, no lítica: fija los cationes divalentes para evitar la agregación dependiente de cationes y mantener la suspensión de leucocitos en forma de células individuales. No contribuye prácticamente en nada a la lisis, que la impulsa el cloruro de amonio.

Una nota sobre la cuestión del "10X". El ACK se suministra y se usa normalmente a 1X. Algunos proveedores venden un concentrado 10X que se diluye en agua antes de usarlo. Una solución madre 10X no es isotónica y nunca debe aplicarse a las células sin diluir.

La selectividad del ACK no se debe a que los eritrocitos sean frágiles. Es consecuencia de dos proteínas que los eritrocitos maduros poseen en enorme cantidad y los leucocitos no.

El cloruro de amonio en solución está en equilibrio con amoniaco y protones. El amoniaco sin carga atraviesa libremente la membrana del eritrocito. Dentro de la célula capta un protón y se convierte en amonio, lo que consume protones intracelulares y desplaza el equilibrio entre dióxido de carbono y bicarbonato catalizado por la anhidrasa carbónica. Los eritrocitos contienen una actividad anhidrasa carbónica muy alta, de modo que esta equilibración es rápida.

El bicarbonato producido se intercambia después por cloruro extracelular mediante la banda 3 (AE1), el intercambiador aniónico del eritrocito, presente en aproximadamente un millón de copias por célula, que cataliza un intercambio electroneutro de bicarbonato por cloruro, uno a uno. El resultado neto de este bucle, conocido como ciclo de Jacobs-Stewart, es una acumulación neta continua de cloruro de amonio dentro de la célula. El agua entra por obligación osmótica, la célula se hincha y la membrana falla.

Los leucocitos no tienen ni la actividad anhidrasa carbónica ni la densidad de banda 3 necesarias para hacer funcionar este ciclo a una velocidad apreciable. Captan algo de amoniaco y experimentan una subida transitoria del pH intracelular, pero no acumulan soluto con la rapidez suficiente para hincharse y romperse en los pocos minutos que dura el protocolo. Por eso el tiempo importa tanto: la diferencia entre un eritrocito y un leucocito en ACK es cinética, no absoluta. Si las células permanecen el tiempo suficiente, los leucocitos también sufren.

Del mecanismo se derivan directamente dos consecuencias. Primera, la lisis es más rápida a temperatura ambiente que en hielo, porque cada paso del ciclo depende de la temperatura; enfriar el tampón es el motivo más frecuente de que la lisis parezca incompleta. Segunda, la alcalinización intracelular transitoria que experimentan los leucocitos no es biológicamente neutra. Para lecturas funcionales sensibles al pH citosólico, como los ensayos de flujo de calcio, estallido oxidativo o fagocitosis, la separación por gradiente de densidad suele ser una opción más segura que la lisis con cloruro de amonio.

Esta es la aplicación estándar para la que se diseñó el ACK. Los volúmenes que siguen corresponden a un bazo de ratón adulto.

1. Prepare una suspensión de células individuales. Disgregue el tejido a través de un filtro celular de 70 micras hacia PBS frío o medio sin suero, empujando con el émbolo de una jeringa. Enjuague el filtro.
2. Sedimente las células. Centrifugue a 300-400 x g durante 5 minutos a 4 °C. Aspire el sobrenadante por completo; el sobrenadante residual diluye el tampón de lisis y ralentiza la reacción.
3. Resuspenda en ACK. Añada 1-3 mL de tampón de lisis ACK 1X por bazo. Las instrucciones de Lonza dan la regla general para cualquier sedimento: añadir un volumen de ACK comparable al volumen del sedimento. Resuspenda con suavidad y por completo: los agregados se lisan de forma desigual.
4. Incube. De 1 a 5 minutos a temperatura ambiente, mezclando con suavidad. El protocolo de Lonza especifica agitar el tubo con movimiento circular durante 30-60 segundos. Muchos laboratorios observan la suspensión y se detienen en cuanto pasa de rojo opaco a rojo translúcido y transparente, lo que suele tardar 1-2 minutos. No supere los 5 minutos.
5. Detenga la reacción por dilución. Llene de inmediato el tubo hasta al menos 10 volúmenes con PBS o medio sin suero. Lo que detiene el ACK es la dilución, no una neutralización.
6. Lave. Centrifugue a 300 x g durante 5 minutos y deseche el sobrenadante. El sedimento debería ser ya blanco o rosa pálido.
7. Repita si es necesario. Si el sedimento sigue visiblemente rojo, repita los pasos 3-6 una vez. Una segunda ronda es normal en el bazo; una tercera indica que algo salió mal antes, normalmente una resuspensión incompleta o un tampón frío.
8. Filtre y cuente. Pase por un filtro de 40-70 micras para eliminar los restos celulares y los agregados de células lisadas, cuente después con azul de tripano y continúe.

La médula ósea sigue el mismo protocolo con una incubación más corta, normalmente de 30-90 segundos, porque la carga de eritrocitos es menor.

La capa leucocitaria y la sangre diluida necesitan más tampón en proporción a la muestra y una incubación más larga, habitualmente de 5-10 minutos a temperatura ambiente con 10-20 volúmenes de ACK por volumen de células sedimentadas. Los fabricantes discrepan respecto a la sangre completa: Gibco incluye la sangre completa tratada con EDTA entre los tipos de muestra previstos, mientras que las instrucciones de uso de Lonza indican explícitamente que el producto no debe emplearse para lisar sangre completa. Siga las instrucciones que acompañan al material que realmente ha comprado.

Lisis incompleta: el sedimento sigue rojo. Causas, por orden de frecuencia: tampón usado frío o directamente del frigorífico (atempérelo primero a temperatura ambiente); sedimento no resuspendido del todo, con agregados a los que el tampón no llega; tampón insuficiente para la carga de eritrocitos; exceso de sobrenadante residual que diluye el tampón; tampón caducado o congelado y descongelado repetidamente. Los eritrocitos residuales no son un problema meramente estético: obstruyen la fluídica del citómetro, distorsionan los recuentos automáticos y añaden restos celulares a las preparaciones posteriores.

Lisis excesiva: la viabilidad baja y el rendimiento cae. El error de protocolo más frecuente con diferencia es dejar las células demasiado tiempo en ACK. Pasados unos cinco minutos, los leucocitos empiezan a hincharse y a morir, los granulocitos son los primeros afectados, y los epítopos de superficie pueden perderse o alterarse lo suficiente como para afectar a la tinción para citometría de flujo. Si la viabilidad tras la lisis es inferior al 85-90% en una preparación fresca de bazo y la manipulación del tejido fue limpia, el paso de lisis es lo primero que hay que revisar.

Las células se agregan después de la lisis. El ADN libre procedente de las células lisadas suele ser la causa. Añadir DNasa I en el paso de lavado, o incluir EDTA en el tampón de lavado, normalmente lo resuelve. Filtrar por un filtro de 40 micras inmediatamente después del último lavado elimina los agregados ya formados.

Las reacciones enzimáticas posteriores no funcionan. El EDTA arrastrado desde el tampón de lisis quela el calcio y el magnesio e inhibirá cualquier enzima dependiente de cationes divalentes que use a continuación: enzimas de restricción, polimerasas en algunos sistemas de tampón y, en particular, colagenasa o dispasa. Lave dos veces en un tampón que contenga cationes divalentes antes de cualquier paso enzimático, y no lleve nunca células tratadas con ACK directamente a una digestión con dispasa o colagenasa.

Los ensayos funcionales se comportan de forma extraña. La alcalinización intracelular transitoria descrita antes puede alterar el estado de activación, el manejo del calcio y las mediciones de estallido respiratorio. Si una lectura funcional no concuerda con el fenotipo obtenido por citometría, compárela con células del mismo donante separadas por gradiente de densidad antes de concluir nada biológico.

Aparece contaminación días después. El ACK es una solución acuosa sencilla, sin actividad antimicrobiana ni conservante. Preparado en el laboratorio con agua sin filtrar, o decantado repetidamente de un frasco compartido, es un vehículo cómodo para introducir contaminación en una preparación por lo demás limpia. Filtre a 0.22 micras, prepare alícuotas y trátelo con el mismo cuidado que un medio.

El cloruro de amonio es irritante para la piel, los ojos y las vías respiratorias, y resulta nocivo si se ingiere. A las concentraciones aquí empleadas la solución es suave, pero el sólido no lo es, y pesarlo genera polvo. Péselo en una vitrina de gases o con extracción localizada, use protección ocular y evite inhalar el polvo.

No mezcle soluciones de cloruro de amonio con lejía de hipoclorito. Este es el único peligro realmente grave asociado a un reactivo por lo demás benigno. Las sales de amonio reaccionan con el hipoclorito y forman cloramina gaseosa, tóxica por inhalación. Los laboratorios que descontaminan con lejía los frascos de aspiración de residuos deben saber que verter residuos de ACK en una trampa con lejía supone un riesgo real de cloramina. Deseche los residuos de cloruro de amonio por separado, o dilúyalos abundantemente con agua antes de que alcancen cualquier hipoclorito.

El contacto con bases fuertes libera amoniaco gaseoso por la misma razón de fondo.

La endotoxina importa en inmunología. El ACK se usa casi exclusivamente sobre células inmunitarias, que son las más sensibles a la contaminación por lipopolisacárido. Un tampón preparado con agua desionizada de laboratorio con contenido de endotoxina desconocido puede cebar o activar precisamente las células que va a fenotipar, y el efecto parecerá biología. Use agua de grado para cultivo celular con una especificación declarada de endotoxina y, para inmunología funcional, use un tampón comercial con un límite de endotoxina documentado.

Almacenamiento y estabilidad. Una vez preparado y filtrado, el ACK es estable durante meses en refrigeración y protegido de la luz. El tampón comercial 1X suele tener una caducidad de 12 meses. No lo congele y descongele repetidamente. Deseche cualquier frasco que se vuelva turbio o que desarrolle partículas.

El ACK no es la única forma de eliminar los eritrocitos, y no siempre es la mejor.

La lisis hipotónica (con agua) funciona según el mismo principio osmótico, pero de forma tosca: exposición breve a agua destilada seguida de la restitución de la tonicidad con solución salina concentrada. Es barata y no requiere más reactivos que agua y PBS 10X, pero la ventana entre lisar los eritrocitos y dañar los leucocitos es mucho más estrecha que con el ACK, y la reproducibilidad entre operadores es mala. Sobrevive sobre todo como recurso de emergencia.

La separación por gradiente de densidad (Ficoll-Paque, Percoll, Lymphoprep) elimina a la vez eritrocitos y granulocitos por densidad de flotación, sin lisar nada. Es más suave, no expone los leucocitos al amonio ni a cambios de pH intracelular, y es la opción correcta para los ensayos funcionales. Los costes son el tiempo, el precio por muestra, la pérdida de los granulocitos si los quería y una técnica más difícil de ejecutar de forma reproducible a gran escala.

Los reactivos comerciales de fijación y lisis usados en citometría de flujo clínica lisan los eritrocitos y fijan los leucocitos en un solo paso. Son excelentes para el inmunofenotipado de sangre completa e inútiles si después necesita células vivas.

No lisar en absoluto es una opción legítima cuando el método posterior tolera los eritrocitos: algunas separaciones con perlas magnéticas, por ejemplo, no se ven afectadas.

Para la tarea concreta para la que se creó el ACK, preparar esplenocitos o células de médula ósea de ratón viables para cultivo, clasificación o transferencia adoptiva, el ACK sigue siendo el estándar porque es rápido, barato, lo bastante suave y reproducible cuando se respetan los tiempos.