PBS frente a DPBS: en qué se diferencian y cuál conviene usar

La solución salina tamponada con fosfato es una solución salina isotónica tamponada cerca del pH fisiológico por un par fosfato monobásico/dibásico. No contiene glucosa, ni aminoácidos, ni proteína, ni bicarbonato. Es una solución de manipulación —para enjuagar monocapas, diluir células, transportar células entre pasos y lavar el suero—, no un medio en el que se puedan mantener las células.

El par fosfato es lo que la hace útil fuera del incubador. La segunda disociación del ácido fosfórico tiene un pKa de unos 7.2, casi exactamente el pH al que se cultivan las células, de modo que un tampón fosfato mantiene bien el pH en aire ambiente. Los medios tamponados con bicarbonato dependen del sistema del ácido carbónico, cuyo pKa relevante es de unos 6.1, y por eso necesitan una atmósfera de CO2 para mantener el pH 7.4. Esta es la razón por la que un paso de lavado en la mesa de trabajo se hace con PBS y no con medio.

DPBS es la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, tomada de la formulación que Renato Dulbecco y Marguerite Vogt describieron en 1954 mientras desarrollaban ensayos de placa para virus animales. «DPBS» designa, por tanto, una receta histórica concreta. «PBS» designa toda una clase de soluciones, y distintos proveedores venden bajo ese nombre productos que difieren de forma apreciable.

Comparar los dos productos de Gibco que llevan exactamente estos nombres hace tangible la diferencia.

El PBS pH 7.4 de Gibco contiene cloruro de sodio a 9.0 g/L (155 mM), fosfato de potasio monobásico a 144 mg/L (1.06 mM) y fosfato de sodio dibásico heptahidratado a 795 mg/L (2.97 mM). El fosfato total es de unos 4.0 mM, y no contiene nada de cloruro de potasio.

El DPBS de Gibco sin calcio ni magnesio contiene cloruro de sodio a 8.0 g/L (137.9 mM), cloruro de potasio a 200 mg/L (2.67 mM), fosfato de potasio monobásico a 200 mg/L (1.47 mM) y fosfato de sodio dibásico heptahidratado a 2160 mg/L (8.06 mM). El fosfato total es de unos 9.5 mM.

Así pues, el DPBS lleva menos cloruro de sodio, añade cloruro de potasio y contiene aproximadamente 2.4 veces más fosfato. La consecuencia práctica es la capacidad tamponante: a unos 9.5 mM de fosfato, el DPBS resiste un desplazamiento de pH bastante mejor que un PBS de 4 mM cuando se le añaden células, reactivos ácidos o un chorro de medio. Si va a mantener una suspensión celular veinte minutos sobre la mesa, esa diferencia es real.

Una advertencia sobre la palabra PBS. La receta que la mayoría de los laboratorios de biología molecular preparan a partir de polvo o de un protocolo de tipo Sambrook —8 g/L de NaCl, 0.2 g/L de KCl, 1.44 g/L de Na2HPO4 y 0.24 g/L de KH2PO4— se acerca a la formulación de Dulbecco, con unos 12 mM de fosfato total. Ese «PBS» de preparación propia está más cerca del DPBS que de un frasco comercial etiquetado como PBS pH 7.4. Lea siempre la formulación de la etiqueta en lugar de deducir la composición de las tres o cuatro letras del frente.

Tanto el PBS como el DPBS se venden en una versión con calcio y magnesio y en otra sin ellos. Esta es la elección que cambia los resultados experimentales, y es independiente de que el frasco diga PBS o DPBS.

El DPBS de Gibco con calcio y magnesio añade cloruro de calcio a 100 mg/L (0.90 mM de Ca2+) y cloruro de magnesio hexahidratado a 100 mg/L (0.49 mM de Mg2+) sobre la misma base. No cambia nada más.

Ambos cationes son estructurales para la adhesión celular. Las cadherinas —las proteínas que unen unas células con otras en las uniones adherentes— son dependientes de calcio por definición; sus dominios extracelulares necesitan Ca2+ unido para adoptar la conformación rígida que permite la unión, y pierden función adhesiva y se vuelven sensibles a las proteasas cuando se retira el calcio. Las integrinas, que fijan las células a la matriz extracelular, coordinan un catión divalente en el sitio de adhesión dependiente de ion metálico de su bolsillo de unión al ligando y no unen el ligando sin él.

Si se retiran el Ca2+ y el Mg2+, se desestabilizan ambos sistemas a la vez. Si se añaden, se conservan los dos. En eso consiste toda la decisión.

El error más frecuente con estas soluciones es lavar una monocapa con una solución que contiene calcio y magnesio justo antes de añadir la tripsina, y preguntarse después por qué las células tardan doce minutos en despegarse y salen en láminas.

El lavado previo a la tripsinización tiene dos cometidos. El evidente es retirar el suero, porque el suero contiene alfa-1-antitripsina y otros inhibidores de proteasas que neutralizarán la tripsina que está a punto de añadir. El menos evidente es extraer los cationes divalentes de las uniones, de modo que los contactos entre cadherinas ya estén aflojados cuando llegue la enzima. Un lavado con Ca/Mg cumple el primer cometido y deshace activamente el segundo.

El resultado es una digestión más larga. Una digestión más larga significa mayor proteólisis del proteoma de superficie, menor viabilidad y más de esa agregación que estropea un recuento en hemocitómetro o una suspensión de células individuales para citometría de flujo o secuenciación. Las soluciones estándar de Trypsin-EDTA están formuladas ellas mismas en una solución salina equilibrada sin calcio ni magnesio y contienen EDTA precisamente para quelar los cationes residuales, así que un lavado con Ca/Mg hace que el EDTA de su reactivo de disociación se gaste en deshacer su propio paso de lavado.

El error contrario también existe. Si lava repetidamente una monocapa adherente con una solución sin Ca/Mg cuando lo que quiere es que las células se queden en su sitio —durante un protocolo de inmunofluorescencia, antes de la fijación o entre pasos de estimulación—, perderá células de la placa y verá una morfología irregular y retraída. Para esos pasos, la versión con calcio y magnesio es la elección correcta.

La solución salina equilibrada de Hanks es el tercer frasco en esta discusión, y se diferencia de ambas salinas fosfatadas en dos aspectos que deciden cuándo recurrir a ella.

En primer lugar, el HBSS contiene D-glucosa a 1.0 g/L (5.6 mM). El PBS y el DPBS no contienen ninguna fuente de energía. Cualquier procedimiento en el que las células permanezcan en la solución más de unos pocos minutos a 37 C —disociación de tejidos, perfusión de órganos, un sorting largo, imagen sobre platina termostatizada— debería emplear HBSS o EBSS en lugar de PBS.

En segundo lugar, el HBSS no es principalmente un tampón fosfato. Contiene solo unos 0.78 mM de fosfato total (fosfato de potasio monobásico 60 mg/L más fosfato de sodio dibásico 48 mg/L) y en su lugar utiliza bicarbonato de sodio a 350 mg/L (4.17 mM). Ese bajo nivel de bicarbonato es deliberado: las sales de Hanks están formuladas para mantener el pH en aire ambiente, en un recipiente cerrado, sin incubador de CO2.

La solución salina equilibrada de Earle responde al diseño opuesto. Contiene bicarbonato de sodio a 2.2 g/L (26.2 mM) y está pensada para usarse en una atmósfera de 5% CO2. Si deja EBSS en la mesa abierta, se volverá alcalina a medida que se escapa el CO2; si mete un medio basado en las sales de Hanks en un incubador al 10% de CO2, se acidificará. La regla general que dan los proveedores es ajustar el bicarbonato a la atmósfera: por debajo de unos 1.5 g/L para aire ambiente o 4% CO2, de 1.5 a 2.2 g/L para el 5%, de 2.2 a 3.4 g/L para el 7% y por encima de 3.5 g/L para el 10%.

El HBSS y el EBSS contienen además ambos calcio y magnesio en su forma estándar, y ambos se venden también sin Ca/Mg para trabajos de disociación, exactamente igual que las salinas fosfatadas.

Use un PBS o un DPBS sin calcio ni magnesio para: enjuagar el suero de una monocapa antes de la disociación con tripsina, TrypLE o EDTA; diluir o resuspender células para el recuento; lavar sedimentos celulares antes de la lisis; preparar suspensiones de células individuales para citometría de flujo o secuenciación de célula única; y como diluyente de las soluciones de disociación basadas en EDTA.

Use un PBS o un DPBS con calcio y magnesio para: lavar células adherentes que quiere mantener adheridas; los pasos de lavado en inmunocitoquímica e inmunofluorescencia; ensayos en los que los cationes divalentes son funcionalmente necesarios, como la unión mediada por integrinas o por lectinas; y resuspender células que deban conservar su capacidad de adhesión superficial.

Use HBSS o EBSS en lugar de cualquiera de los dos cuando: las células vayan a permanecer en la solución más de unos quince minutos a 37 C, o el procedimiento necesite una fuente de energía: disociación de tejido primario, perfusión, transporte de biopsias, manipulación prolongada de células vivas. Elija las sales de Hanks para el trabajo al aire y las sales de Earle para el trabajo en incubador de CO2.

No utilice ninguna de ellas como medio. Ninguna de estas soluciones contiene aminoácidos, vitaminas ni proteína. Las células mantenidas en una solución salina equilibrada se agotan, y la viabilidad cae de forma apreciable en una o dos horas incluso en las versiones que llevan glucosa.

Un frasco etiquetado como DPBS no está necesariamente a pH 7.4. Las especificaciones del DPBS de Gibco son pH 7.0-7.3 sin calcio ni magnesio y pH 7.0-7.2 con ellos, mientras que el producto vendido como PBS pH 7.4 está ajustado a 7.4. Si su protocolo depende de un pH de partida —un colorante sensible al pH, un fluoróforo con rendimiento cuántico dependiente del pH, un ensayo de unión—, consulte el certificado de análisis en lugar de darlo por supuesto.

Los concentrados y los polvos suelen ser sin Ca/Mg. Los fosfatos de calcio y de magnesio tienen una solubilidad limitada, de modo que los concentrados 10X, los formatos en polvo y todo lo destinado a autoclavarse se suministran por lo general sin cationes divalentes, que se añaden después a partir de una disolución estéril aparte. Si diluye un DPBS 10X y espera que contenga calcio, revise la etiqueta.

Autoclavar una salina fosfatada con Ca/Mg puede provocar su precipitación. La esterilización por filtración a 0.2 um es la vía más segura para cualquier salina fosfatada que contenga calcio.

El rojo de fenol es opcional y no influye en el tamponamiento. La mayor parte del PBS y del DPBS se suministra sin él. Las versiones con rojo de fenol existen sobre todo para poder ver a simple vista una desviación grosera del pH o una contaminación; interferirán en las lecturas de absorbancia y fluorescencia igual que lo hace el rojo de fenol del medio.

El PBS-EDTA es un producto distinto. Un PBS o DPBS con 0.5 mM de EDTA es un reactivo de disociación, no un tampón de lavado. No lo sustituya por PBS simple en un paso de enjuague, y no deje las células en él mientras se ocupa de otra cosa.