Ensayo de endotoxinas en el cultivo celular

La endotoxina es el lipopolisacárido (LPS) de la membrana externa de las bacterias Gram negativas. Se libera durante el crecimiento y se descarga masivamente cuando la célula se lisa, lo que significa que matar la bacteria no elimina la endotoxina. Una disolución puede ser perfectamente estéril y estar al mismo tiempo muy contaminada con endotoxina.

Tres propiedades la convierten en un problema persistente en el agua y los reactivos de laboratorio:

• Es termoestable. El autoclave estándar a 121 °C no la destruye. Se necesita despirogenación por calor seco, y el mínimo validado habitualmente para materiales termoestables como el vidrio es de 30 minutos a 250 °C.
• Atraviesa los filtros esterilizantes. El monómero de LPS pesa unos pocos kilodalton; incluso en forma de agregados atraviesa sin dificultad las membranas de 0.2 µm. La filtración esterilizante no es una etapa de despirogenación. Su eliminación exige ultrafiltración (membranas de en torno a 10 kDa de corte retienen los agregados de LPS), adsorción por afinidad o por membrana cargada, o destilación.
• Se adsorbe a las superficies y se acumula. Los sistemas de agua que permanecen estancados desarrollan biopelícula, y la biopelícula libera endotoxina de forma continua. Un sistema de agua que cumple una especificación microbiológica puede seguir incumpliendo la de endotoxinas.

La conclusión práctica es que la endotoxina debe eliminarse por diseño a nivel de las materias primas y del sistema de agua. No existe ningún filtro que se pueda poner al final del proceso para resolverlo.

La endotoxina se expresa en unidades de endotoxina (EU) y no en masa, porque los distintos quimiotipos de LPS difieren notablemente en potencia biológica. La unidad se define frente a una endotoxina estándar internacional de referencia procedente de E. coli, y la conversión de uso extendido establece que 1 EU corresponde aproximadamente a 0.1–0.2 ng de la endotoxina del estándar de referencia. Conviene tomarla como una conversión de orden de magnitud, no exacta: es válida para el material de referencia y solo aproximadamente para el LPS que realmente contenga la muestra. Cuando la relación se expresa al revés, en EU/ng, al mismo estándar de referencia suelen asignársele en torno a 5–10 EU por ng.

Se encontrará con tres denominadores:

• EU/mL para líquidos: agua, medios, sueros, tampones. Es la unidad del cultivo celular.
• EU/mg para sólidos y proteínas purificadas, normalizada a la masa de la sustancia y no al volumen de disolución.
• EU/dispositivo o EU/unidad para artículos terminados, que es una unidad de liberación de fabricación y no de cultivo celular.

En los productos parenterales fabricados, los límites se derivan de una dosis pirogénica umbral expresada por kilogramo de masa corporal, con un umbral general de 5 EU/kg por hora y una cifra mucho menor, 0.2 EU/kg, para los productos de administración intratecal. Se trata de especificaciones de liberación de producto empleadas en el control de calidad de fabricación; no son límites de cultivo celular y no se trasladan a un frasco de cultivo.

La endotoxina no es una simple impureza inerte. En las células que expresan el complejo receptor TLR4–MD-2–CD14 es un agonista potente y específico, activo a concentraciones de picogramos por mililitro. Lo que ocurra después depende por completo de qué células se estén cultivando.

Muy sensibles: monocitos y macrófagos, células dendríticas, sangre completa y preparaciones de PBMC, y en general las células inmunitarias primarias. En estos sistemas la endotoxina induce directamente la liberación de citocinas, y un lote de suero o una fuente de agua contaminados producirán un resultado con apariencia de efecto biológico real. Todo experimento que informe de una respuesta de citocinas frente a un estímulo nuevo necesita un control de endotoxinas sobre la preparación del estímulo: este es uno de los factores de confusión más frecuentes en la bibliografía inmunológica.

Moderadamente sensibles: células estromales mesenquimales, células madre pluripotentes y de otros tipos, células endoteliales primarias y hepatocitos. Entre los efectos descritos figuran alteraciones de la proliferación, cambios en la trayectoria de diferenciación y variaciones en la expresión de marcadores de superficie.

Relativamente insensibles: las líneas inmortalizadas establecidas, como CHO, HEK293 o HeLa, toleran cargas de endotoxina que arruinarían un cultivo inmunitario primario. Por eso un laboratorio que solo haya cultivado células CHO puede no haberse planteado nunca el problema de las endotoxinas, y por eso el paso al trabajo con células primarias suele ser el momento en que aparece de pronto como una variable inexplicada.

En fabricación —terapia celular, producción de vacunas y de biológicos— la endotoxina pasa a ser un atributo controlado del proceso y no una molestia, porque se arrastra hasta el producto y debe cumplir una especificación de liberación definida. Eso impulsa la demanda de materias primas de baja endotoxina con certificados de análisis específicos de lote.

En orden aproximado según los problemas que causa cada vía:

1. El agua. Es el mayor contribuyente individual por volumen en cualquier preparación de medios. El agua purificada que ha quedado estancada, un lecho de desionización que lleva demasiado tiempo en servicio o un circuito de distribución con un ramal muerto liberarán endotoxina procedente de la biopelícula. El agua destinada a cultivo celular debe especificarse por su contenido en endotoxinas, no solo por su resistividad.
2. Los sueros. El suero fetal bovino ha sido históricamente el principal responsable, por su origen biológico y por las condiciones de recolección. El suero moderno se filtra y se analiza, y los grados se diferencian explícitamente por su contenido en endotoxinas.
3. Materias primas y polvos. Aminoácidos, sales, glucosa, hidrolizados y, en particular, suplementos proteicos como la albúmina o la transferrina. Los hidrolizados vegetales y de levadura son una fuente conocida. Precisamente por eso existen los grados de baja endotoxina.
4. Material de laboratorio y envases. Vidrio lavado pero no despirogenado. Plásticos que no son de grado cultivo de tejidos. Frascos reutilizados. Tubos de silicona.
5. El propio laboratorio. Baños termostáticos, bandejas de agua de los incubadores humidificados y cualquier agua templada en reposo. Estos medios permiten el crecimiento fácil de microorganismos Gram negativos y, aunque el cultivo nunca llegue a contaminarse, los aerosoles y la manipulación transfieren endotoxina.

Obsérvese qué falta en esta lista: sus células. La endotoxina llega con lo que se añade, no con lo que se cultiva.

Todos los ensayos de endotoxinas actuales se basan en la misma bioquímica: una cascada proteolítica de la hemolinfa del cangrejo herradura que se activa cuando el LPS se une al Factor C, la primera enzima de la cadena.

El LAL (lisado de amebocitos de Limulus) emplea la cascada natural completa a partir de amebocitos de Limulus polyphemus o Tachypleus tridentatus. Existe en tres formatos oficiales dentro del capítulo USP <85>:

• Gelificación: la cascada coagula el lisado. La lectura es binaria a una sensibilidad definida del lisado (λ), y la cuantificación se obtiene de una serie de diluciones. Sencillo, barato, sin instrumentación, y sigue siendo el método de arbitraje cuando un resultado se cuestiona. Semicuantitativo y laborioso.
• Turbidimétrico: mide el aumento de turbidez a medida que se forma la coagulina. La versión cinética registra el tiempo hasta el inicio frente a una curva patrón y es totalmente cuantitativa.
• Cromogénico: la enzima activada escinde un sustrato sintético péptido–cromóforo y libera p-nitroanilina, que se mide a 405 nm. El cromogénico cinético es el formato cuantitativo más utilizado y llega hasta cerca de 0.001 EU/mL.

El rFC (Factor C recombinante) sustituye el lisado de origen animal por Factor C expresado de forma recombinante y un sustrato fluorogénico. Mide la misma actividad endotoxínica y ofrece resultados equivalentes, con un intervalo cuantitativo típico de aproximadamente 0.005–5 EU/mL. Como emplea únicamente la primera enzima de la cascada, no responde al (1→3)-β-D-glucano, lo que supone una ventaja real: el β-glucano procedente de los filtros de celulosa y de algunos componentes de los medios provoca falsos positivos en el LAL a través de la rama lateral del Factor G. El rFC tiene su propio capítulo oficial, USP <86>, y su adopción se debe tanto a esa especificidad como al hecho de que elimina la dependencia de la captura de cangrejos herradura.

El ensayo de activación de monocitos (MAT) es algo distinto: un ensayo in vitro que mide la liberación de citocinas por células monocíticas humanas y que, por tanto, detecta también pirógenos no endotoxínicos. Es un método de control de calidad de fabricación, no un ensayo rutinario de reactivos de cultivo celular.

La validación del método importa más que la elección del método. Los medios de cultivo, los sueros y los tampones interfieren con frecuencia en la cascada, ya sea inhibiéndola (cationes divalentes, quelantes, pH fuera del intervalo 6–8, proteasas séricas) o potenciándola. Cada tipo de muestra debe cualificarse mediante un ensayo de inhibición/potenciación: se añade una concentración conocida de endotoxina a la muestra como control positivo de producto (CPP) y se confirma una recuperación dentro del 50–200%. Si la recuperación queda fuera de esa ventana, hay que diluir la muestra —hasta la máxima dilución válida (MDV), calculada a partir del límite de especificación y de la sensibilidad del ensayo— o tratarla para eliminar la interferencia. Una matriz de muestra sin validar produce cifras que no significan nada.

No existe un límite reglamentario único para los materiales de cultivo celular como sí lo hay para los inyectables. Lo que existe es un conjunto de convenciones sectoriales bien asentadas, más lo que exija cada aplicación concreta.

• Agua. El límite de la farmacopea para el agua para inyección es de 0.25 EU/mL, y el agua de grado cultivo celular suele especificarse en la misma cifra. El agua reactivo para LAL —empleada en el propio ensayo, no en el cultivo— debe estar <0.005 EU/mL.
• Suero fetal bovino. El estándar general del sector es <10 EU/mL, suficiente para la mayoría de las líneas celulares establecidas. Los grados de baja endotoxina se especifican en <1 EU/mL y los de endotoxina ultrabaja por debajo de 0.1 EU/mL. Para células inmunitarias primarias, células madre o uso en fabricación, la diferencia merece el sobrecoste; para el trabajo rutinario con CHO o HEK293, normalmente no.
• Tampones, sales y suplementos. ≤1 EU/mL es la especificación habitual de grado cultivo celular para reactivos líquidos como el HEPES o el PBS.
• Agentes de selección y disoluciones de moléculas pequeñas. Habitualmente de ≤1 a ≤5 EU/mL, lo que refleja que se usan muy diluidos en el medio final.

Ese último punto es el que debe guiar el razonamiento. Lo que importa es la concentración de endotoxina en el medio final, no en el frasco. Un suplemento a 5 EU/mL añadido al 1% v/v aporta 0.05 EU/mL al medio terminado; un suero a 10 EU/mL añadido al 10% aporta 1 EU/mL y es el término dominante. Conviene sumar las contribuciones de todos los componentes antes de decidir cuál mejorar: comprar agua de endotoxina ultrabaja y añadir después suero estándar al 10% es gastar el dinero en el sitio equivocado.

Agua. La producción combina varias etapas ortogonales: ósmosis inversa para eliminar el grueso de los sólidos disueltos y las macromoléculas, destilación y/o ultrafiltración a través de una membrana de en torno a 10 kDa de corte para retener los agregados de LPS, y recirculación continua con tratamiento UV y sanitización periódica para impedir que la biopelícula se restablezca. El sistema de distribución importa tanto como la purificación: los ramales muertos, los puntos de muestreo estancados y los accesorios mal sanitizados son el lugar por donde vuelve la endotoxina. El llenado del envase final se realiza en recipientes despirogenados, y el lote terminado se analiza por LAL o rFC y se libera frente a una especificación declarada.

Sueros. La endotoxina se controla en primer lugar mediante la recolección y la manipulación: una recolección higiénica, el enfriamiento rápido y el mantenimiento de la cadena de frío limitan el crecimiento de Gram negativos en la materia prima, lo cual es mucho más eficaz que cualquier cosa que se haga después. La filtración en serie a través de membranas de grado esterilizante progresivamente más finas reduce la carga particulada y microbiana. Algunos grados de baja endotoxina añaden una etapa de ultrafiltración o de adsorción, a costa de eliminar parte de los componentes promotores del crecimiento que hacen útil al suero, y ese es el compromiso que hay detrás de la diferencia de precio entre grados. Cada lote se analiza y el resultado figura en el certificado de análisis.

Qué preguntar al proveedor. Una especificación declarada es necesaria pero no suficiente. Pida el certificado de análisis específico de lote con el valor medido, no solo el límite de especificación; el método empleado (LAL por gelificación, cromogénico cinético o rFC); y si el método se validó para esa matriz con un control positivo de producto. «Baja endotoxina» sin una cifra y un método en un documento específico de lote es publicidad, no datos.

En su propio laboratorio. Despirogene el vidrio con calor seco a 250 °C durante 30 minutos en lugar de confiar en el autoclave. Utilice material plástico y puntas de pipeta de un solo uso, certificados como libres de endotoxinas, para el trabajo sensible a endotoxinas. No almacene agua purificada: úsela recién obtenida, porque el agua almacenada desarrolla biopelícula. Prepare y filtre los medios sin demora en vez de dejar disoluciones intermedias a temperatura ambiente. Y mantenga un control de endotoxinas en cualquier experimento cuya lectura sea una respuesta inmunitaria.