Insulina humana recombinante en el cultivo celular

La insulina humana es una proteína pequeña de 51 aminoácidos dispuesta en dos cadenas -- una cadena A de 21 residuos y una cadena B de 30 -- unidas por dos puentes disulfuro intercatenarios, con un tercer puente disulfuro dentro de la cadena A. Su peso molecular es de aproximadamente 5.8 kDa (5808 Da) y su punto isoeléctrico se sitúa en torno a pH 5.3-5.4, un dato que condiciona por completo su manipulación.

En el cultivo celular, la insulina es uno de los pocos suplementos que convierten un medio basal en algo en lo que las células crecen realmente sin suero. Sus funciones son:

• Impulsar la captación de nutrientes. La insulina favorece el transporte de glucosa y la captación de aminoácidos, lo que en un cultivo en división rápida determina directamente la velocidad de crecimiento y la biomasa y el producto que puede sostener un biorreactor.
• Señalización anabólica. Estimula la síntesis de proteínas, la síntesis de ácidos nucleicos y la lipogénesis, y suprime las rutas catabólicas.
• Señalización de supervivencia. La activación del receptor de insulina pone en marcha la vía PI3K-Akt, de carácter antiapoptótico. En medio sin suero, donde faltan las señales de supervivencia que normalmente aportan los factores de crecimiento del suero, esto explica buena parte de lo que hace la insulina.
• Transporte intracelular y apoyo metabólico general, razón por la cual aparece en casi todas las formulaciones sin suero, sea cual sea el tipo celular.

Lo que más se pasa por alto: en cultivo, la insulina actúa en gran medida como agonista del receptor de IGF-1. La insulina circulante fisiológica se mueve en el intervalo nanomolar. La concentración utilizada en cultivo -- 5-10 ug/mL, aproximadamente 1-2 uM -- es unas mil veces mayor. La insulina se une a su propio receptor con alta afinidad y al receptor de IGF-1, estrechamente relacionado, con una afinidad mucho menor, pero a concentraciones micromolares esa interacción de baja afinidad se vuelve significativa. Por tanto, el efecto mitogénico de la insulina en cultivo está mediado en buena parte por la señalización del receptor de IGF-1 y no por la señalización metabólica clásica de la insulina.

Esto no es un tecnicismo. Explica por qué las concentraciones de cultivo están tan por encima de las fisiológicas, por qué los análogos de IGF-1 pueden sustituir a la insulina y por qué un cultivo suplementado con insulina es un mal modelo para estudiar la señalización fisiológica de la insulina. Si el objeto de estudio es la acción de la insulina en sí, la concentración habitual del suplemento queda muy fuera del intervalo fisiológico y saturará ambos receptores.

Recombinante, no de origen animal. Históricamente, la insulina para cultivo celular se extraía de páncreas bovino o porcino. La insulina humana recombinante, expresada en E. coli o en levaduras como Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris, la ha desplazado por las mismas razones que rigen en todo el sector: es libre de origen animal, lo que elimina una vía de entrada de agentes adventicios y la carga documental asociada; corresponde a la secuencia humana, con lo que se evitan las pequeñas diferencias de especie propias de la insulina bovina y porcina; y es mucho más consistente entre lotes que un extracto de tejido.

Para cualquier proceso libre de origen animal o libre de componentes xenogénicos, la insulina recombinante no es opcional. Además, al montar una formulación definida a partir de componentes individuales, conviene comprobar que la insulina de un suplemento es realmente recombinante: un medio descrito como sin suero no es necesariamente libre de origen animal.

La forma con zinc. La insulina se suministra normalmente como polvo cristalino estabilizado con zinc. Los iones de zinc coordinan los monómeros de insulina para formar hexámeros -- dos iones de zinc por hexámero -- y la forma cristalina hexamérica es notablemente más estable que la insulina monomérica, tanto en almacenamiento como frente a la agregación. Por eso la insulina comercial para cultivo celular se describe como insulina de zinc o indicando un contenido de zinc especificado.

Consecuencias prácticas:

• El contenido de zinc forma parte de la especificación y conviene tenerlo presente, porque el zinc es en sí mismo un oligoelemento con actividad biológica. En las cantidades que acompañan a la insulina suele ser despreciable frente a los demás componentes del medio, pero en trabajos sensibles al zinc debe contabilizarse.
• El hexámero se disocia al diluirse. A las concentraciones utilizadas en el medio, la insulina se encuentra como monómeros y dímeros, de modo que la forma con zinc afecta a la estabilidad en almacenamiento y no a la actividad biológica.
• Existen preparaciones sin zinc y con contenido de zinc especificado para aplicaciones en las que el zinc resulta relevante.

Formatos. El polvo seco es el formato más habitual para uso a granel y el de mayor vida útil. Las disoluciones estériles listas para usar evitan el paso de disolución descrito más abajo, que es el principal riesgo práctico en la manipulación de la insulina, y compensan el sobreprecio en trabajos de menor escala.

El estándar es 5-10 ug/mL, y 10 ug/mL es la concentración que aporta un suplemento ITS a 1X. Sirve para la gran mayoría de los tipos celulares y es un punto de partida sólido para una formulación nueva.

El intervalo práctico es más amplio, aproximadamente de 0.1 a 20 ug/mL según el tipo celular y lo que se le pida al cultivo:

• Muchos procesos de producción con CHO y otros trabajan a 5-20 mg/L (equivalente a 5-20 ug/mL), a veces en el extremo superior en cultivos de alta densidad en lote alimentado.
• Las células primarias sensibles y algunos sistemas de células madre utilizan bastante menos, del orden de 0.1-5 ug/mL.
• Algunos cultivos neurales y especializados excluyen la insulina de forma deliberada. Existen formulaciones sin insulina precisamente porque la insulina activa la señalización del receptor de IGF-1, que puede interferir en la diferenciación, en los ensayos de supervivencia o en los experimentos metabólicos. Si se realiza un experimento de este tipo, conviene comprobar si el suplemento contiene insulina: es fácil pasarlo por alto cuando el suplemento se añade por costumbre.

Optimice en lugar de heredar. Titule todo el intervalo con sus propias células y mida la velocidad de crecimiento, la densidad viable máxima, la viabilidad y el título de producto o la variable funcional de interés. Dado que la insulina es uno de los componentes más caros de un medio definido a escala, y que más no siempre es mejor, merece la pena establecer el óptimo.

La estabilidad en el medio es una limitación real. La insulina se degrada en medio completo a 37 C en un plazo de horas a un día aproximadamente, más rápido en presencia de proteasas y a temperatura elevada. En un cultivo en lote corto esto carece de importancia. En un proceso en lote alimentado o en perfusión que dure una semana o más, la insulina añadida al inicio ha desaparecido mucho antes del final, y los procesos que dependen de ella necesitan reposición a través de la alimentación. Esta degradación es una de las principales razones por las que el sector desarrolló alternativas más estables.

Alternativas a la insulina. LongR3 IGF-1 es un análogo modificado del factor de crecimiento similar a la insulina de tipo 1, con un extremo N-terminal ampliado y una sustitución que reduce enormemente su unión a las proteínas de unión a IGF. Es bastante más potente y más estable que la insulina, por lo que se utiliza a concentraciones mucho menores -- normalmente en decenas de nanogramos por mililitro en lugar de microgramos -- y se emplea ampliamente en medios de bioproceso como sustituto directo. Dado que la insulina en cultivo actúa en gran medida a través del receptor de IGF-1, recurrir a un análogo optimizado de IGF-1 es una sustitución lógica. Es más caro por gramo, pero se usa en una fracción de la masa. También se utiliza IGF-1 nativo, pero es menos estable y queda secuestrado por las proteínas de unión.

Aquí es donde la insulina falla con más frecuencia, y la razón es química elemental.

La insulina es poco soluble cerca del pH neutro. Su punto isoeléctrico está en torno a 5.3-5.4 y, a valores de pH próximos a la neutralidad, tiene carga neta mínima y baja solubilidad. Añadir insulina en polvo directamente al medio de cultivo a pH 7.2-7.4 no funciona: se dispersa como una suspensión sin disolver que parece parcialmente disuelta y después queda retenida en gran parte por el filtro de esterilización. El medio contiene entonces mucha menos insulina de la prevista y el cultivo rinde por debajo de lo esperado por una causa invisible.

Disuelva primero en ácido diluido:

1. Disuelva el polvo en ácido clorhídrico diluido, típicamente 0.01 M (0.01 N), o en ácido acético diluido, a una concentración de disolución madre de unos 4-10 mg/mL. Utilice el volumen mínimo de ácido necesario.
2. Mezcle con suavidad hasta la disolución completa. La insulina es una proteína y se desnaturaliza en las interfases: no agite con vórtex de forma enérgica ni hasta producir espuma. La disolución debe quedar completamente transparente; si no lo está, no está disuelta.
3. Neutralice o diluya sin demora. El almacenamiento prolongado a pH bajo favorece la desamidación y otras formas de degradación química.
4. Esterilice por filtración a través de 0.22 um. Utilice una membrana de baja unión a proteínas: la insulina es pequeña y se adsorbe de forma apreciable a algunos materiales de filtro, y a estas concentraciones tan bajas la pérdida por adsorción es una fuente real de error.
5. Diluya en el medio hasta la concentración de trabajo final. El pequeño volumen de ácido diluido que se arrastra tiene un efecto despreciable sobre el pH de un medio bien tamponado, pero conviene comprobar el pH del medio terminado si se añade un volumen grande de disolución madre.

Almacenamiento. Conserve el polvo seco desecado a 2-8 C o a -20 C según especifique el proveedor, protegido de la humedad. Conserve las disoluciones madre ácidas congeladas en alícuotas de un solo uso y evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación. No mantenga las disoluciones madre de insulina a temperatura ambiente.

La forma más sencilla de evitar todo esto es adquirir una disolución estéril de insulina lista para usar o emplear un suplemento ITS, que aporta la insulina correctamente formulada junto con los demás componentes que suelen acompañarla. Para la mayor parte del trabajo a escala de laboratorio esta es la mejor opción; disolver el polvo compensa a escala de fabricación, donde la diferencia de coste sí resulta apreciable.

La insulina rara vez se utiliza sola. La combinación estándar es ITS -- insulina, transferrina y selenio -- suministrada como concentrado 100X. La composición es constante entre proveedores:

Los tres componentes resuelven problemas distintos, y por eso viajan juntos:

• La insulina aporta la señal de crecimiento y supervivencia e impulsa la captación de nutrientes.
• La transferrina es el transportador de hierro. El hierro es imprescindible para la proliferación celular -- la ribonucleótido reductasa lo requiere --, pero el hierro libre cataliza la química de Fenton y genera radicales hidroxilo. La transferrina entrega el hierro en forma unida y controlada, y además ayuda a reducir la carga de radicales de oxígeno y de peróxido. El mecanismo de entrega importa tanto como la cantidad.
• El selenio, en forma de selenito de sodio, es cofactor de la glutatión peroxidasa y de otras selenoproteínas, y forma parte de la defensa antioxidante de la célula. Conviene fijarse en las unidades: la concentración de trabajo es de nanogramos por mililitro, tres órdenes de magnitud por debajo de los otros dos componentes. El selenio es tóxico a concentraciones más altas y no admite aproximaciones.

Variantes habituales:

• ITS-G: la combinación básica, normalmente con insulina humana recombinante y transferrina humana, disponible en forma libre de origen animal.
• ITS-A: ITS con piruvato de sodio añadido, un sustrato energético adicional y captador de peróxido de hidrógeno.
• ITS-X: ITS con etanolamina añadida, un precursor para la síntesis de fosfatidiletanolamina, útil en células con alta renovación de membrana y a menudo beneficioso en medios bajos en proteína y para hibridomas.

La elección entre ellos es en gran medida empírica. Empiece por ITS-G salvo que tenga motivos para pensar que sus células están limitadas por la disponibilidad de precursores de fosfolípidos, en cuyo caso conviene probar ITS-X, o por el sustrato energético, en cuyo caso corresponde ITS-A.

Compruebe la condición de origen animal. Los suplementos ITS existen tanto en forma libre de origen animal como convencional. Una formulación que contenga transferrina bovina o insulina obtenida de páncreas no es libre de origen animal, con independencia de lo que contenga el resto del medio. Para trabajos libres de componentes xenogénicos y de vía clínica, verifique cada componente y no solo el nombre del producto.

Los suplementos sin insulina existen por buenas razones. Las formulaciones que se suministran explícitamente sin insulina -- incluidas las versiones sin insulina de suplementos neurales habituales -- están pensadas para experimentos en los que la señalización de los receptores de insulina y de IGF-1 falsearía la lectura. Si el experimento trata sobre señalización por factores de crecimiento, metabolismo o diferenciación, utilizar un suplemento sin insulina y añadir después una cantidad definida suele ser un diseño más limpio.

Las pérdidas por adsorción cuentan a estas concentraciones. La insulina es una proteína pequeña que se usa a microgramos por mililitro y se adsorbe a las superficies de vidrio y de plástico. En volúmenes pequeños, en tubuladuras y en medios bajos en proteína la pérdida no es despreciable. La albúmina del medio la reduce de forma sustancial al competir por los sitios de superficie, lo que es una de las varias razones por las que la albúmina y la insulina se emplean juntas con frecuencia. Utilice tubos de baja unión para manipular la disolución madre y no prepare disoluciones intermedias muy diluidas que vayan a permanecer en espera antes de su uso.

No autoclavar. Esterilice únicamente por filtración a 0.22 um. El calor destruye la insulina.

Vigile el fallo silencioso. El modo de fallo característico de la insulina es una formulación que sencillamente rinde poco sin causa aparente, porque la insulina sin disolver quedó retenida en el filtro y el medio nunca contuvo lo que indicaba la receta. Si un medio definido no funciona y la insulina se preparó a partir de polvo, verifique el paso de disolución antes de investigar cualquier otra cosa.

Registre la concentración y el origen en el apartado de métodos. La concentración de insulina varía en un orden de magnitud entre las formulaciones publicadas, y la diferencia tiene consecuencias biológicas. «Medio sin suero con ITS» omite información que el lector necesita para reproducir el trabajo.

Tenga en cuenta la insulina al interpretar los resultados. Puesto que las concentraciones habituales de insulina en cultivo saturan tanto el receptor de insulina como el de IGF-1, cualquier experimento sobre señalización por factores de crecimiento, actividad PI3K-Akt, regulación metabólica o diferenciación se desarrolla sobre un fondo agonista intenso y constante. Esto no es motivo para evitar la insulina, pero sí para declararla, para considerar controles sin insulina y para ser prudente al atribuir un efecto a un tratamiento cuando el cultivo ya recibe una señal de crecimiento saturante.