Medio RPMI 1640

El RPMI 1640 fue desarrollado por George Moore, Robert Gerner y H. Addison Franklin en el Roswell Park Memorial Institute de Buffalo (Nueva York) y se publicó en 1967 en un artículo sobre el cultivo de leucocitos humanos normales. RPMI son las iniciales del instituto; 1640 es el número de la formulación dentro de una serie. Nació como una modificación del McCoy's 5A (a su vez denominado a veces RPMI 1630) y se orientó de lleno a un problema que los medios derivados de Eagle resolvían mal: hacer crecer células linfoblastoides en suspensión.

Ese origen explica casi todos los rasgos distintivos del medio. Las células en suspensión no necesitan —y se ven inhibidas por— la concentración alta de calcio que favorece la adhesión. Los leucocitos cultivados durante días necesitan un sistema tamponante que se mantenga estable a los niveles de CO2 de un incubador estándar. Y el medio tenía que sostener células exigentes en cuanto a su estado redox, razón por la cual contiene glutatión reducido, un componente casi único entre los medios basales clásicos.

Desde entonces, el RPMI 1640 ha demostrado ser mucho más general de lo que su nombre sugiere. Sostiene perfectamente muchas líneas adherentes y es la base estándar del panel tumoral NCI-60, del cultivo de hibridomas, del trabajo con células mononucleares de sangre periférica y de la mayoría de las líneas humanas de leucemia y linfoma.

La formulación estándar del RPMI 1640, tal como la suministran todos los fabricantes principales:

Sales inorgánicas y componentes mayoritarios

Aminoácidos (mg/L)

L-arginina 200; L-asparagina 50; ácido L-aspártico 20; L-cistina·2HCl 65; ácido L-glutámico 20; glicina 10; L-histidina 15; L-hidroxiprolina 20; L-isoleucina 50; L-leucina 50; L-lisina·HCl 40; L-metionina 15; L-fenilalanina 15; L-prolina 20; L-serina 30; L-treonina 20; L-triptófano 5; sal disódica dihidratada de L-tirosina 29; L-valina 20.

Vitaminas (mg/L)

i-inositol 35; cloruro de colina 3; ácido paraaminobenzoico 1; ácido fólico 1; niacinamida 1; tiamina·HCl 1; D-pantotenato de calcio 0.25; biotina 0.2; riboflavina 0.2; vitamina B12 (cianocobalamina) 0.005.

Merece la pena detenerse en cuatro puntos de esta lista, porque son los que hacen que el RPMI sea RPMI:

• El calcio es muy bajo. 0.42 mM, frente a 1.8 mM en DMEM y MEM. Es algo deliberado: un calcio bajo desalienta la adhesión entre células y con el sustrato, que arruinaría el cultivo en suspensión.
• El fosfato es muy alto. Unos 5.6 mM solo por el fosfato disódico, aproximadamente seis veces el del DMEM. Esto confiere al RPMI una capacidad tamponante secundaria apreciable más allá del bicarbonato y contribuye a su estabilidad durante el manejo rutinario.
• Contiene glutatión reducido a 1 mg/L. Ningún otro medio basal clásico lo incluye. Aporta capacidad antioxidante, lo que importa en el caso de los leucocitos primarios.
• Contiene biotina, vitamina B12, PABA e hidroxiprolina, ninguna de las cuales aparece en DMEM ni en MEM. La cobertura vitamínica del RPMI es más amplia que la de los medios derivados de Eagle, pese a que sus concentraciones de aminoácidos son mucho menores.

Conviene fijarse también en lo que falta: el RPMI no contiene ninguna fuente de hierro ni elementos traza. Los aporta el suero.

Son los dos medios basales más utilizados y no son intercambiables. Las diferencias principales están en el calcio, el fosfato, la glucosa, la concentración de aminoácidos y el bicarbonato; véase la tabla comparativa de esta página para el detalle componente a componente.

En la práctica, la decisión suele reducirse a tres preguntas.

¿El cultivo está en suspensión o adherido? Las células linfoides y hematopoyéticas en suspensión van en RPMI. Las líneas fibroblásticas y epiteliales firmemente adherentes van en DMEM. El calcio bajo del RPMI juega en contra de una adhesión fuerte; los 1.8 mM de calcio del DMEM la favorecen.

¿Qué dice el protocolo publicado de la línea? Para las líneas establecidas esto no es una cuestión de preferencia. Jurkat, K562, THP-1, Raji, U937, HL-60, MOLT-4, la mayoría de los miembros del panel NCI-60 y casi todos los hibridomas tienen RPMI 1640 en sus protocolos de referencia. HEK293, HeLa, NIH/3T3, Vero, COS-7 y C2C12 tienen DMEM. Cambiar una línea de uno a otro modifica el tiempo de duplicación, la densidad de saturación y con frecuencia la expresión de proteínas, de modo que invalida la comparación con la bibliografía salvo que se vuelva a caracterizar.

¿Cuál es la demanda metabólica? El DMEM, con 25 mM de glucosa y aproximadamente cuatro veces la concentración de aminoácidos del RPMI, está pensado para cultivos densos, rápidos y de alta demanda. El RPMI, con 11 mM de glucosa y niveles moderados de aminoácidos, está pensado para células que crecen a velocidad moderada en suspensión durante días. Forzar un cultivo de alta demanda en RPMI obliga a alimentarlo con más frecuencia.

Existe un híbrido realmente útil: el RPMI 1640 modificado por la ATCC, que eleva la glucosa a 4.5 g/L y añade 1 mM de piruvato de sodio y 10 mM de HEPES. Conserva el carácter iónico del RPMI y a la vez aporta la reserva de nutrientes de un medio con glucosa alta, y es una buena opción para hibridomas y otros cultivos que dependen del RPMI pero alcanzan densidades elevadas.

Líneas linfoides y hematopoyéticas establecidas. Jurkat, K562, HL-60, THP-1, U937, Raji, Ramos, MOLT-4, Daudi y la mayoría de las líneas linfoblastoides B y T. La suplementación estándar es un 10% de FBS y 2 mM de L-glutamine.

Leucocitos humanos primarios. PBMC, linfocitos T y B aislados, monocitos y cultivos de células dendríticas. Es el caso de uso para el que se diseñó originalmente el RPMI. En cultivos primarios prolongados, su contenido en glutatión y su amplia cobertura vitamínica son ventajas apreciables.

Hibridomas y producción de anticuerpos. El RPMI 1640, a menudo con suplementos adicionales, es la base clásica para hibridomas. Hoy los medios químicamente definidos para hibridomas son la norma en producción, pero el RPMI sigue siendo el estándar para la fusión y la clonación.

Muchas líneas tumorales adherentes. MCF-7, A549, PC-3, HT-29, SK-MEL y muchísimas otras se mantienen habitualmente en RPMI. No existe ninguna regla que reserve el RPMI a las células en suspensión: el panel NCI-60 se cultiva en RPMI tanto en sus miembros adherentes como en los que crecen en suspensión.

Dónde el RPMI es una mala elección: células que necesitan calcio alto para formar uniones o diferenciarse, procesos de lote alimentado a muy alta densidad sin una formulación modificada, y el crecimiento clonal a baja densidad sin suero, que requiere una base derivada del F-12 o diseñada específicamente.

Los 2000 mg/L (23.8 mM) de bicarbonato de sodio del RPMI 1640 están ajustados a una atmósfera de 5% CO2, que es la que utilizan prácticamente todos los incubadores. Esta es una de las ventajas prácticas discretas del RPMI frente al DMEM, cuyos 3700 mg/L de bicarbonato se formularon para 10% CO2 y que, por tanto, queda alcalino al 5%.

El fosfato elevado del RPMI le proporciona además un tampón secundario que actúa con independencia del CO2, de modo que el medio tolera mejor el tiempo en la mesa de trabajo que un medio con poco fosfato y el mismo nivel de bicarbonato. Aun así pierde CO2 y deriva hacia la alcalinidad si se deja abierto, así que conviene mantener corto el tiempo con la botella abierta.

Las variantes con HEPES se suministran a 25 mM (o a 10 mM en la modificación de la ATCC). Úselas para citometría de flujo, imagen de células vivas, sesiones prolongadas de separación celular o cualquier protocolo que mantenga a las células fuera de una atmósfera de CO2 más de unos minutos. Hay que tener en cuenta dos salvedades: el HEPES genera peróxido de hidrógeno cuando se expone a la luz y, a 25 mM, resulta tóxico para algunas células primarias. No lo trate como una mejora gratuita.

El RPMI sin rojo de fenol está disponible para ensayos de fluorescencia y absorbancia, para citometría de flujo, donde el rojo de fenol aumenta el fondo, y para el trabajo con respuesta hormonal: el rojo de fenol tiene una débil actividad estrogénica, un factor de confusión documentado en líneas positivas para el receptor de estrógenos como MCF-7.

Suero. Lo estándar es un 10% de FBS; algunos protocolos usan un 20% para cultivos primarios o de baja densidad, y un 5% para líneas bien adaptadas.

Glutamina. El RPMI contiene 300 mg/L (unos 2 mM) cuando se suministra con glutamina. Como la glutamina se degrada en solución a amoníaco, el RPMI sin glutamina con adición reciente en el momento de uso —o el dipéptido estable L-alanil-L-glutamina— da resultados más consistentes, sobre todo en cultivos que se alimentan una vez por semana en lugar de cada dos días.

2-mercaptoetanol. 50 µM es lo estándar para el cultivo de linfocitos primarios, hibridomas y linfocitos T de ratón. Favorece la captación de cistina y ayuda a mantener el glutatión intracelular. Es un requisito real para algunos cultivos primarios, no un extra opcional.

Piruvato de sodio y aminoácidos no esenciales. 1 mM de piruvato y NEAA 1x son adiciones frecuentes, en particular para los protocolos del NCI-60 y para cultivos con suero reducido. El RPMI ya contiene varios aminoácidos no esenciales, de modo que suplementar con NEAA aporta aquí menos que en el DMEM.

El RPMI sin glucosa se emplea en trabajos de metabolismo: sustituyendo la glucosa por galactosa para forzar el metabolismo oxidativo, o ajustando la glucosa a un nivel definido. El RPMI es mejor base que el DMEM para esto, porque su glucosa de partida ya es más próxima a la fisiológica.

El RPMI en polvo es la vía económica a gran escala. Se suministra sin bicarbonato de sodio, que se añade en la reconstitución (2.0 g/L); el pH se ajusta unas 0.1–0.2 unidades por debajo del valor objetivo para compensar la subida durante la filtración, y la solución se esteriliza por filtración a 0.22 µm.

El RPMI 1640 líquido se conserva a 2–8 °C protegido de la luz, con una caducidad típica sin abrir de 12–24 meses. Una vez añadida la glutamina, cuente con unas cuatro semanas de vida útil de trabajo; si el medio lleva suero, de dos a cuatro semanas.

La exposición a la luz es el problema de conservación más subestimado. La riboflavina, el ácido fólico y el triptófano se fotodegradan y, cuando hay HEPES, la reacción genera peróxido de hidrógeno. Un medio guardado en una estantería abierta bajo la iluminación del laboratorio pierde eficiencia de siembra de forma medible. Guarde las botellas en un frigorífico cerrado, no en una nevera expositora iluminada, y no deje alícuotas de trabajo en la mesa entre usos.

Atempere solo lo que vaya a usar. Llevar repetidamente una botella entera de 500 mL a 37 °C acelera la hidrólisis de la glutamina y desplaza el bicarbonato. Para la mayoría de los cambios de medio basta con la temperatura ambiente.

Un ligero viraje del rosa hacia el magenta después de haber abierto una botella corresponde a una pérdida normal de bicarbonato y se revierte en el incubador. La turbidez, las partículas o un viraje al amarillo en una botella sin inocular no son normales: deséchela y revise su filtración o su técnica aséptica antes que el medio.

Suponer que el RPMI solo sirve para células en suspensión. Una gran proporción de líneas tumorales adherentes se mantiene en él de forma rutinaria.

Cambiar una línea de DMEM a RPMI (o al revés) a mitad de un proyecto. Cambian la velocidad de crecimiento, la densidad de saturación y la expresión de algunos genes. Si tiene que cambiar, adapte gradualmente a lo largo de varios pases y vuelva a establecer la línea base de sus ensayos.

Olvidar el 2-mercaptoetanol en el cultivo de linfocitos primarios o de hibridomas. Su ausencia es una causa frecuente de que los cultivos primarios de linfocitos T rindan por debajo de lo esperado.

Usar RPMI para células que necesitan calcio. A 0.42 mM, el RPMI no sostendrá la formación de uniones ni la diferenciación dependiente de calcio de la que dependen algunos protocolos epiteliales.

Tratar la modificación de la ATCC como si fuera RPMI normal. Difiere en glucosa (4.5 frente a 2.0 g/L), piruvato y HEPES. Deje constancia de cuál utilizó.

Añadir glutamina y no fechar la botella. El amoníaco procedente de la degradación de la glutamina se acumula y es tóxico para las células linfoides a concentraciones más bajas de las que toleran muchas líneas adherentes.