MEM alfa (α-MEM) y medio esencial mínimo

Harry Eagle publicó el medio esencial mínimo en 1959 en Science, tras varios años determinando de forma sistemática qué necesita realmente una célula de mamífero en cultivo. El MEM es deliberadamente mínimo: trece aminoácidos esenciales, ocho vitaminas, glucosa y las seis sales inorgánicas de la solución salina equilibrada de Earle (cloruro de calcio, cloruro de potasio, sulfato de magnesio, cloruro de sodio, fosfato de sodio y bicarbonato de sodio). Nada más. Ese minimalismo era precisamente la intención: convertía al MEM en una referencia definida frente a la que poder poner a prueba los requerimientos de cualquier tipo celular.

El α-MEM es la «modificación alfa», publicada en 1971 por Clifford Stanners, Gerald Eliceiri y Howard Green mientras trabajaban con ribosomas en células híbridas de ratón y hámster. Necesitaban un medio más rico que sostuviera células híbridas y exigentes sin llegar a las concentraciones de aminoácidos muy elevadas del DMEM. Su modificación mantuvo exactamente la base salina y la glucosa del MEM y añadió nutrientes:

• Todos los aminoácidos no esenciales: alanina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, prolina y serina, además de cisteína
• Piruvato de sodio a 110 mg/L (1 mM)
• Ácido ascórbico (vitamina C) a 50 mg/L, biotina a 0.1 mg/L y vitamina B12 a unos 1.3 mg/L
• Ácido lipoico a 0.2 mg/L
• De forma opcional, ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos

El resultado es un medio nutricionalmente mucho más rico que el MEM pero que comparte con él la composición iónica y el requerimiento de CO2, y por eso el α-MEM se comporta de manera distinta al DMEM aunque ambos sean «MEM enriquecidos».

Esta es la formulación estándar del MEM con sales equilibradas de Earle, el medio que se vende como «MEM», «EMEM» o «MEM Eagle» sin más matices.

Sales inorgánicas y otros componentes

Aminoácidos (mg/L): solo los trece aminoácidos esenciales

L-arginina·HCl 126; L-cistina·2HCl 31; L-histidina·HCl·H2O 42; L-isoleucina 52; L-leucina 52; L-lisina·HCl 73; L-metionina 15; L-fenilalanina 32; L-treonina 48; L-triptófano 10; L-tirosina (como sal disódica dihidratada) 52; L-valina 46; más L-glutamine 292.

Vitaminas (mg/L): ocho

Cloruro de colina 1; D-pantotenato de calcio 1; ácido fólico 1; niacinamida 1; piridoxal·HCl 1; tiamina·HCl 1; i-inositol 2; riboflavina 0.1.

Eso es todo el medio. El MEM no contiene aminoácidos no esenciales, ni nucleósidos, ni piruvato, ni ascorbato, ni biotina, ni vitamina B12, ni ácido lipoico, ni elementos traza. El minimalismo es deliberado: el propósito de Eagle era establecer los requerimientos mínimos de una célula de mamífero, y se esperaba que todo lo demás lo aportara el suero. También es la razón por la que el MEM sigue siendo útil hoy en virología, producción de vacunas y estudios de requerimientos nutricionales, donde los componentes añadidos falsearían el resultado.

Existe además una versión de MEM con sales equilibradas de Hanks, idéntica salvo que el bicarbonato de sodio baja a unos 350 mg/L para su uso a la concentración atmosférica de CO2 (véase el apartado sobre las sales, más abajo). Otras dos variantes habituales son el MEM con aminoácidos no esenciales ya añadidos y el MEM 2x para las capas de recubrimiento en los ensayos de placa.

Formulación estándar del α-MEM (con nucleósidos; la versión sin nucleósidos es idéntica salvo por la ausencia de los ocho nucleósidos):

Sales inorgánicas y otros componentes

Aminoácidos (mg/L)

L-alanina 25; L-arginina·HCl 126; L-asparagina·H2O 50; ácido L-aspártico 30; L-cisteína·HCl·H2O 100; L-cistina·2HCl 31; ácido L-glutámico 75; glicina 50; L-histidina·HCl·H2O 42; L-isoleucina 52; L-leucina 52; L-lisina·HCl 73; L-metionina 15; L-fenilalanina 32; L-prolina 40; L-serina 25; L-treonina 48; L-triptófano 10; L-tirosina (como sal disódica dihidratada) 52; L-valina 46.

Vitaminas (mg/L)

Ácido ascórbico 50; i-inositol 2; cloruro de colina 1; D-pantotenato de calcio 1; ácido fólico 1; niacinamida 1; piridoxal·HCl 1; tiamina·HCl 1; riboflavina 0.1; biotina 0.1; vitamina B12 ~1.3.

Nucleósidos (mg/L, en la versión con nucleósidos)

Adenosina 10; citidina 10; guanosina 10; uridina 10; timidina 10; 2'-desoxiadenosina 10; 2'-desoxiguanosina 10; 2'-desoxicitidina·HCl 11.

Conviene retener dos contrastes con el DMEM. El α-MEM tiene la cuarta parte de glucosa (1000 frente a 4500 mg/L) y bastante menos bicarbonato (2200 frente a 3700 mg/L, de ahí 5% CO2 en lugar del 10%). Pero cuenta con un conjunto de nutrientes más amplio —ascorbato, biotina, B12, ácido lipoico y el panel completo de aminoácidos no esenciales—, ninguno de los cuales está en el DMEM. El α-MEM no es un DMEM más flojo: es un diseño distinto.

Esta es la elección de mayor trascendencia al pedir α-MEM, y equivocarse arruina en silencio los experimentos de selección.

Las células sintetizan nucleótidos por dos rutas: la ruta de novo, que construye purinas y pirimidinas desde cero y depende de la dihidrofolato reductasa (DHFR) y de la timidilato sintasa, y la ruta de recuperación (salvage), que recicla nucleósidos preformados mediante enzimas como la HGPRT y la timidina cinasa. Los nucleósidos del medio alimentan la ruta de recuperación.

Use α-MEM sin nucleósidos cuando haya que bloquear la ruta de recuperación o cuando la síntesis de novo sea su marcador de selección:

• Selección basada en DHFR en CHO-DXB11 y CHO-DG44. Estas líneas son deficientes en DHFR y no pueden fabricar nucleótidos de novo. Solo sobreviven si se les aportan nucleósidos, de modo que el α-MEM sin nucleósidos es exactamente la presión selectiva que identifica a las células que han incorporado un vector de expresión portador de DHFR. Aportar nucleósidos anula por completo la selección. Este es el caso de uso clásico y la razón por la que el α-MEM sin nucleósidos es un reactivo estándar en bioproducción.
• Amplificación con metotrexato. La lógica es la misma: el metotrexato inhibe la DHFR, y los nucleósidos del medio rescatarían precisamente a las células contra las que se quiere seleccionar.
• Selección con HAT y HT en el trabajo con hibridomas, donde el objetivo es controlar qué ruta está disponible.

Use α-MEM con nucleósidos cuando simplemente quiera un medio rico: expansión rutinaria de células estromales mesenquimales, cultivo de médula ósea, crecimiento de células primarias y mantenimiento de líneas deficientes en DHFR antes de iniciar la selección. Los nucleósidos reducen la carga metabólica de la síntesis de nucleótidos y en general mejoran el crecimiento de las células primarias más exigentes.

Si su protocolo no menciona los nucleósidos y no está haciendo una selección, la versión con nucleósidos es la opción por defecto más segura. Si su protocolo implica DHFR, metotrexato, HAT o HT, léalo con atención: la respuesta suele ser «sin nucleósidos», y los dos productos se confunden con frecuencia porque sus nombres de catálogo se diferencian en una sola palabra.

El MEM se suministra sobre dos bases salinas distintas, y la diferencia tiene que ver enteramente con dónde piensa mantener el cultivo.

El MEM con sales equilibradas de Earle contiene 2200 mg/L de bicarbonato de sodio y está diseñado para un incubador con 5% CO2. Es la forma estándar de laboratorio y es lo que significa «MEM» sin más matices. El α-MEM utiliza esta base.

El MEM con sales equilibradas de Hanks contiene solo unos 350 mg/L de bicarbonato de sodio y está pensado para su uso en recipientes sellados o a la concentración atmosférica de CO2: históricamente, para el transporte de tejidos, el cultivo en frascos cerrados y los procedimientos realizados en la mesa de trabajo. Si coloca un MEM con base de Hanks en un incubador con 5% CO2 en un frasco ventilado, el pH caerá por debajo de la capacidad del tampón.

La regla se generaliza más allá del MEM: la concentración de bicarbonato y el CO2 del incubador forman una pareja que debe estar ajustada, porque en estos medios el pH lo fija la relación entre el bicarbonato y el CO2 disuelto. Siempre que vea en una ficha técnica una cifra de bicarbonato inesperadamente baja, compruebe si el producto es una formulación con base de Hanks o para recipiente sellado antes de meterlo en un incubador.

Células estromales mesenquimales (MSC). El α-MEM es la base estándar para la expansión de MSC humanas y animales derivadas de médula ósea y de tejido adiposo, normalmente con un 10–20% de FBS o con un suplemento definido. Aquí su glucosa baja es una ventaja: la glucosa alta tiene efectos documentados sobre la proliferación y el potencial de diferenciación de las MSC.

Cultivos óseos y hematopoyéticos. Los osteoblastos, los ensayos de diferenciación de osteoclastos, los cultivos estromales de médula ósea y los cultivos de médula a largo plazo emplean convencionalmente α-MEM. Su contenido en ascorbato es directamente relevante para el trabajo con osteoblastos, ya que el ascorbato es necesario para la hidroxilación del colágeno y el depósito de matriz.

CHO-DXB11 y CHO-DG44. Como se ha descrito más arriba, el α-MEM con y sin nucleósidos es la pareja estándar para la selección con DHFR y la amplificación con metotrexato en estas líneas de producción.

Células primarias en general. Los condrocitos, las células de la pulpa dental, las capas alimentadoras de queratinocitos, los fibroblastos primarios y muchos otros cultivos primarios crecen mejor en α-MEM que en MEM simple, gracias a los aminoácidos no esenciales, el piruvato, el ascorbato y los nucleósidos.

El MEM simple sigue utilizándose cuando se busca una base mínima y bien definida: virología y producción de vacunas en Vero y MRC-5, ensayos de placa y estudios de requerimientos nutricionales, donde los componentes añadidos falsearían el resultado.

Atención al calcio: el α-MEM contiene 1.8 mM, lo mismo que el DMEM. Esto conviene a los cultivos adherentes y en diferenciación, pero lo convierte en una mala base para los protocolos de queratinocitos que exigen un calcio bajo.

CO2. Los 2200 mg/L (26 mM) de bicarbonato del α-MEM están ajustados a 5% CO2. Este es el valor estándar de los incubadores, de modo que el α-MEM mantiene el pH de forma más predecible que el DMEM sin necesidad de ajustes.

Glutamina. 2 mM (292 mg/L) en las formulaciones con glutamina. Se degrada en solución a amoníaco, así que el medio sin glutamina con adición reciente, o el dipéptido estable L-alanil-L-glutamina, da cultivos más consistentes a largo plazo, algo especialmente relevante en la expansión de MSC, donde los cultivos se prolongan durante semanas.

Suero. Lo habitual es un 10% de FBS; los protocolos de MSC especifican a menudo un 15–20% y, cada vez más, un suplemento definido o lisado plaquetario humano para el trabajo de grado clínico.

Estabilidad del ascorbato. Los 50 mg/L de ácido ascórbico del α-MEM son realmente útiles, pero también realmente inestables: se oxida en solución en cuestión de días a semanas. Para la diferenciación osteogénica, en la que el ascorbato impulsa el depósito de colágeno, suplemente con ascorbato-2-fosfato recién preparado en lugar de confiar en lo que quede en una botella de medio que lleva un mes abierta. El ascorbato-2-fosfato es la forma estabilizada que se emplea en los protocolos de diferenciación exactamente por este motivo.

Conservación. A 2–8 °C y en oscuridad, normalmente 12–24 meses sin abrir. Tras añadir la glutamina, unas cuatro semanas. El α-MEM es más sensible a la luz que el MEM simple, porque el ascorbato, la riboflavina y el folato se fotodegradan. Guárdelo en un frigorífico cerrado.

El α-MEM en polvo se suministra sin bicarbonato de sodio; añada 2.2 g/L en la reconstitución, ajuste el pH unas 0.2 unidades por debajo del valor objetivo para compensar la subida durante la filtración y esterilice por filtración a 0.22 µm.

Pedir la versión de nucleósidos equivocada. Los dos productos se diferencian en una palabra del nombre de catálogo y por completo en su comportamiento bajo selección con DHFR o metotrexato. Compruebe la ficha técnica, no la etiqueta del estante.

Suponer que el α-MEM es un DMEM con poca glucosa. No lo es. Distinto bicarbonato (2200 frente a 3700 mg/L), distinto requerimiento de CO2, distinto conjunto de vitaminas, y contiene nucleósidos, ascorbato, ácido lipoico y piruvato que el DMEM no tiene.

Confiar en el ascorbato de la botella para los experimentos de diferenciación. El ácido ascórbico se degrada en solución. Use ascorbato-2-fosfato como suplemento recién preparado para el trabajo osteogénico.

Meter un MEM con sales de Hanks en un incubador de CO2. Sus 350 mg/L de bicarbonato no pueden tamponar a 5% CO2 y el cultivo se acidifica.

Cambiar los cultivos de MSC entre α-MEM y DMEM a mitad de un estudio. Cambian el contenido de glucosa, de calcio y de micronutrientes, y con ellos se desplazan la velocidad de proliferación y el potencial de diferenciación.