Azul de tripano y el ensayo de viabilidad por exclusión de colorante

El azul de tripano (CAS 72-57-1, C34H24N6Na4O14S4, masa molecular 872.88 g/mol) es un colorante bis-azoico desarrollado originalmente como tinción para tripanosomas, de donde procede su nombre. En cultivo celular se emplea para una única tarea: distinguir las células con la membrana plasmática intacta de las que no la tienen.

El colorante lleva cuatro grupos sulfonato y presenta una carga negativa intensa a pH fisiológico. Esa carga es la base completa del ensayo. Una membrana plasmática sana es esencialmente impermeable a una molécula tetraaniónica grande de este tamaño, de modo que el colorante queda excluido y el interior celular permanece sin teñir. Cuando se pierde la integridad de la membrana, el colorante entra libremente y se une a las proteínas intracelulares, dando a la célula una tonalidad azul característica bajo iluminación de campo claro.

Por eso la técnica se denomina con propiedad ensayo de exclusión de colorante y no ensayo de viabilidad. Lo que se mide es la exclusión de un colorante por una membrana. La viabilidad es una inferencia extraída de esa medición, y en la distancia entre ambas se sitúan la mayoría de los errores asociados al azul de tripano.

Al microscopio, una célula viable sin teñir se ve brillante, redondeada y refringente, con un halo nítido. Una célula muerta aparece aplanada, azul oscuro, a menudo algo hinchada, y pierde su borde refringente. El contraste es suficiente para puntuar a simple vista a 100x de aumento, lo que explica en buena medida que el método haya sobrevivido prácticamente sin cambios desde la década de 1920.

El azul de tripano para recuento celular se suministra como solución al 0.4% (p/v) —4 mg/mL— casi siempre en tampón isotónico (0.81% de cloruro de sodio y 0.06% de fosfato de potasio es una formulación habitual) y esterilizado por filtración a través de una membrana de 0.22 µm.

La cifra del 0.4% es un compromiso de trabajo, no una constante física:

• Lo bastante intenso para puntuar deprisa. Al 0.4%, las células muertas alcanzan la saturación completa de color a los pocos segundos de la mezcla, de modo que el operador no tiene que esperar a que se desarrolle la tinción.
• Lo bastante diluido para ver a través. El azul de tripano es intensamente coloreado. Muy por encima del 0.4%, el fondo de la cámara de recuento se oscurece hasta el punto de que las células sin teñir pierden contraste y las células pequeñas resultan difíciles de localizar.
• Compatible con la dilución estándar 1:1. Como el protocolo mezcla volúmenes iguales de muestra y colorante, las células quedan en realidad en un 0.2% de colorante. Suministrar la solución madre al 0.4% hace que la aritmética de la dilución sea un factor limpio de 2.

Algunos protocolos usan azul de tripano al 0.2% o al 0.1% para células muy pequeñas o para contadores automáticos con óptica sensible. Si cambia la concentración del colorante, el factor de dilución del cálculo cambia con ella y las comparaciones con recuentos históricos dejan de ser válidas.

Conserve la solución a temperatura ambiente o a 2-8 °C, protegida de la luz. Las soluciones de azul de tripano forman precipitados finos con el tiempo, sobre todo tras la refrigeración; fíltrela con un filtro de jeringa de 0.2 µm antes de usarla si observa partículas, ya que los cristales de colorante se confunden fácilmente con células muertas pequeñas o con restos celulares.

Este es el protocolo manual estándar con un hemocitómetro de Neubauer mejorado. El tiempo total es de unos cinco minutos por muestra una vez adquirida la práctica.

Antes de empezar. Limpie el hemocitómetro y el cubreobjetos con etanol al 70% y papel sin pelusa. Presione el cubreobjetos sobre la cámara hasta que aparezcan los anillos de Newton —bandas tenues de interferencia con los colores del arcoíris— en los bordes de contacto. Su presencia confirma que el cubreobjetos está asentado a la altura correcta de 0.1 mm, que es lo que hace válido el cálculo del volumen.

1. Prepare una suspensión de células individuales. Para cultivos adherentes, desprenda con Trypsin-EDTA, neutralice y pipetee con suavidad para deshacer los agregados. Los agregados son la mayor fuente aislada de error en el recuento manual, porque un agregado de ocho células se puntúa como un solo objeto.
2. Tome una muestra representativa. Mezcle bien la suspensión, pero sin formar espuma, y retire de inmediato una alícuota. Las células sedimentan en uno o dos minutos; una muestra tomada de un tubo en reposo no reflejará el cultivo.
3. Mezcle 1:1 con el colorante. Combine 10 µL de suspensión celular con 10 µL de azul de tripano al 0.4%. Esto da un factor de dilución de 2. Mezcle pipeteando con suavidad.
4. Espere, pero no mucho. Deje reposar la mezcla alrededor de 1 minuto. No supere los 3-5 minutos antes de contar. El azul de tripano es citotóxico y las células viables lo van incorporando con el reposo, de modo que la viabilidad disminuye cuanto más tiempo espera la muestra. Una muestra contada a los 15 minutos puede dar varios puntos porcentuales menos que la misma muestra a los 2 minutos.
5. Cargue la cámara. Pipetee 10 µL en la muesca del borde del cubreobjetos y deje que la acción capilar llene la cámara en un movimiento continuo. No llene en exceso hasta el foso ni introduzca burbujas. Si la cámara se inunda, límpiela y vuelva a cargarla.
6. Deje sedimentar las células unos 30 segundos y examine después a 100x de aumento total.
7. Cuente los cuatro cuadrantes grandes de las esquinas. Cada cuadrante de esquina mide 1 mm x 1 mm con el cubreobjetos a 0.1 mm por encima, de modo que cada uno encierra 0.1 mm3 = 1 x 10^-4 mL. Cuente por separado las células teñidas y las no teñidas.
8. Aplique una regla de bordes coherente. Cuente las células que tocan las líneas superior e izquierda; no cuente las que tocan las líneas inferior y derecha. Cualquier regla sirve mientras se aplique de forma coherente, porque su finalidad es evitar contar la misma célula en dos cuadrantes contiguos.
9. Compruebe que el recuento está en el intervalo adecuado. Busque 20-50 células por cuadrante de esquina. Por debajo de unas 20, el error de recuento de Poisson se vuelve grande; por encima de unas 100, las células se solapan y se cuentan de menos. Diluya o concentre la muestra y repita si queda fuera de esta ventana.

Cálculo:

``` Células/mL = (recuento medio por cuadrante de esquina) x (factor de dilución) x 10^4

% de viabilidad = (células no teñidas / células totales) x 100 ```

El término 10^4 convierte el volumen de cámara de 1 x 10^-4 mL en una cifra por mililitro. Es una propiedad fija de la geometría del hemocitómetro, no algo que deba ajustarse.

Ejemplo resuelto. Recuentos por cuadrante de esquina de 42, 38, 45 y 39 células no teñidas, más 3, 2, 4 y 3 células teñidas.

• Media total por cuadrante = (45 + 40 + 49 + 42) / 4 = 44
• Media de células no teñidas por cuadrante = 41
• Células totales/mL = 44 x 2 x 10^4 = 8.8 x 10^5 células/mL
• Células viables/mL = 41 x 2 x 10^4 = 8.2 x 10^5 células/mL
• Viabilidad = 164/176 x 100 = 93.2%

Cuente ambos lados de la cámara y promédielos si necesita mayor precisión. El error de recuento sobre un total de 100 células es de aproximadamente el 10% solo por estadística de Poisson, antes de cualquier error de operador o de muestreo.

Los contadores automáticos de azul de tripano aplican exactamente la misma química, sustituyendo el ojo del operador por análisis de imagen. La muestra se mezcla 1:1 con colorante al 0.4% igual que antes, se carga en un portaobjetos desechable o en un casete reutilizable, y se segmenta una imagen de campo claro para clasificar los objetos por tamaño, circularidad y densidad óptica.

Lo que la automatización resuelve realmente es la variabilidad entre operadores y la tarea tediosa de contar una placa entera de muestras. Dos analistas que puntúan el mismo portaobjetos difieren habitualmente en varios puntos porcentuales de viabilidad, y esa diferencia es sistemática: sencillamente, hay personas más dispuestas a dar por muerta una célula pálida.

Lo que la automatización no resuelve es nada de lo que ocurre antes. No puede deshacer un agregado ni convertir en representativa una muestra que no lo es. Además hereda un modo de fallo específico: los restos celulares, los cristales de colorante y los fragmentos celulares del mismo rango de tamaño que las células pequeñas se clasifican como células. Un cultivo en mal estado, lleno de fragmentos, puede producir un recuento automático sustancialmente demasiado alto y una viabilidad demasiado baja.

Recomendaciones prácticas:

• Fije y registre el filtro de tamaño para su tipo celular, y manténgalo constante a lo largo de un experimento. Cambiar el filtro cambia el resultado.
• Verifique un instrumento nuevo o una línea celular nueva frente a recuentos manuales de las mismas muestras antes de confiar en él.
• Considere que una viabilidad por debajo de aproximadamente el 70-80% es un régimen en el que la clasificación automática se degrada, porque las células en proceso de muerte se desplazan hacia tamaños e intensidades de tinción intermedios.
• Los contadores basados en fluorescencia que usan naranja de acridina con yoduro de propidio son bastante más exactos que el azul de tripano en campo claro para muestras con abundantes restos celulares, células primarias o muestras derivadas de sangre, ya que las tinciones nucleares ignoran todo aquello que carece de ADN.

La exclusión con azul de tripano es rápida, barata y suficiente para el subcultivo rutinario. Como medida de la salud del cultivo es realmente poco fiable, y merece la pena entender por qué, porque de ello depende cuándo se necesita otro ensayo.

Solo detecta la muerte tardía. La pérdida de integridad de la membrana es uno de los últimos acontecimientos de la muerte celular. Una célula que ya se ha comprometido con la apoptosis —caspasas activas, ADN fragmentándose, mitocondrias permeabilizadas— excluye perfectamente el azul de tripano durante horas. Un cultivo que da un 95% de viabilidad puede contener una fracción apoptótica considerable que mañana estará muerta. Esta es la limitación más importante de todas. Si está midiendo un tratamiento citotóxico, el azul de tripano subestimará el efecto, y lo subestimará sobre todo en los tiempos tempranos.

No es un ensayo de proliferación ni de función. Las células viables por exclusión de colorante pueden estar detenidas en su crecimiento, senescentes o ser incapaces de producir la proteína que le interesa. La integridad de la membrana no dice nada sobre si una célula hará un trabajo útil.

Las células muertas desaparecen. Las células que ya se han lisado o fragmentado por completo no se cuentan en absoluto. En un cultivo que lleva días deteriorándose, las células más afectadas ya se han desintegrado, de modo que la población superviviente parece engañosamente sana. La viabilidad de un cultivo gravemente colapsado es una cifra con sesgo de supervivencia.

El propio colorante mata. El contacto prolongado reduce la viabilidad medida de una muestra real. Por eso importa la ventana de 3-5 minutos y por eso un lote de muestras debe teñirse de una en una y no todo a la vez.

Las proteínas fijan el colorante. El azul de tripano se une a las proteínas séricas, lo que eleva la tinción de fondo y reduce el contraste. Las muestras en medio con abundante suero, y sobre todo las muestras ricas en proteínas como líquido ascítico o lisados, dan peor discriminación. Lavar las células y pasarlas a PBS antes de teñir mejora la lectura.

La puntuación es subjetiva. Las células parcialmente teñidas, de azul pálido, son frecuentes en un cultivo estresado y distintos operadores las puntúan de forma diferente. Decida de antemano si el azul pálido cuenta como muerta, déjelo por escrito y aplíquelo de forma coherente.

Las muestras pequeñas y de baja viabilidad quedan mal atendidas. El recuento manual necesita aproximadamente 1 x 10^5 células/mL para situarse en la ventana útil de recuento, y la precisión se degrada bruscamente en los extremos.

Ajuste el ensayo a la pregunta. El azul de tripano responde a "cuántas células tengo y cuántas están ya muertas". No responde a "este compuesto está matando mis células" ni a "este cultivo está sano".

• Subcultivo rutinario y densidad de siembra. Azul de tripano. Rápido, barato, da una concentración y una viabilidad en una sola operación.
• Citotoxicidad y curvas dosis-respuesta. Un ensayo metabólico (resazurina, MTT/XTT) o un ensayo de luminiscencia de ATP. Detectan el deterioro funcional mucho antes de la rotura de la membrana y dan una lectura continua apta para ajustar la CI50.
• Distinguir apoptosis de necrosis. Citometría de flujo con anexina V y yoduro de propidio. La anexina V detecta la exposición de fosfatidilserina en la cara externa de la membrana, que ocurre pronto; el yoduro de propidio solo entra tras el fallo de la membrana. Ambos juntos separan las poblaciones apoptóticas tempranas, apoptóticas tardías y necróticas, algo que ningún método de un solo colorante puede hacer.
• Células primarias, hemoderivados y muestras con muchos restos celulares. Tinción nuclear fluorescente, normalmente naranja de acridina con yoduro de propidio, en un contador automático. Los colorantes específicos de ADN ignoran las plaquetas, los eritrocitos y los restos que confunden el recuento en campo claro.
• Ensayos de liberación de una terapia celular o de una cosecha de bioproceso. Habitualmente más de un método ortogonal, porque la integridad de la membrana por sí sola no se acepta como prueba suficiente de un producto funcional.

En un biorreactor o en desarrollo de procesos, la viabilidad por azul de tripano seguida a lo largo de una tanda sigue siendo útil como tendencia. El valor absoluto importa menos que la forma de la curva, y una viabilidad que empieza a caer es una señal real aunque su valor exacto sea optimista.

La viabilidad es mucho más baja de lo esperado. Compruebe primero el tiempo transcurrido entre la tinción y el recuento: es la causa más frecuente. Revise después la tripsinización: una digestión excesiva daña directamente las membranas. Compruebe que el medio y el PBS estaban atemperados; tanto el choque por frío como el estrés osmótico de un tampón mal ajustado se manifiestan como una menor exclusión. Por último, compruebe que el colorante no haya superado su vida útil ni esté muy precipitado.

La viabilidad es inverosímilmente alta en un cultivo que parece enfermo. Sospeche del efecto de supervivencia descrito antes: las células completamente lisadas no se cuentan. Observe el cultivo al microscopio antes de desprenderlo: los restos flotantes y las células adherentes granulosas y vacuoladas dicen más que la cifra. Considere un ensayo metabólico.

Los recuentos no son reproducibles entre réplicas. Casi siempre se debe a agregados o al muestreo. Pipetee la suspensión hasta un estado de células realmente individuales, mezcle justo antes de cada alícuota y compruebe si el recuento va disminuyendo a lo largo de las réplicas, lo que indica que las células sedimentan en el tubo.

Las células se ven grisáceas en lugar de claramente azules o transparentes. Normalmente se debe a un exceso de proteína que fija el colorante. Lave las células, páselas a PBS y vuelva a teñir. Compruebe también que el cubreobjetos esté bien asentado y que el condensador esté ajustado para un buen contraste en campo claro.

La cámara se llena de forma desigual o las células se amontonan en un borde. El cubreobjetos no está asentado o la cámara se llenó en exceso. Limpie, seque, vuelva a asentarlo hasta que aparezcan los anillos de Newton y recargue con un único llenado capilar continuo.

El contador automático no coincide con el recuento manual. Revise el filtro de tamaño y la dilución introducida en el instrumento. Capture un campo e inspeccione directamente la superposición de clasificación: la mayoría de los instrumentos le mostrarán qué han considerado una célula, y la respuesta son con frecuencia restos celulares.

El azul de tripano es un reactivo de laboratorio, no un material terapéutico, y debe manipularse como un producto químico con peligros reconocidos. En varias jurisdicciones está clasificado como sospechoso de ser carcinógeno y tóxico para la reproducción, lo que refleja su parentesco estructural con los colorantes azoicos derivados de la bencidina. Manipúlelo con guantes y bata, trabaje en una cabina de seguridad biológica o con ventilación adecuada al preparar soluciones a partir del polvo, y deseche el material teñido como residuo químico conforme a la normativa local, nunca por el desagüe.

En cuanto a la solución en sí:

• Consérvela a temperatura ambiente o a 2-8 °C, protegida de la luz.
• Fíltrela a través de 0.2 µm antes de usarla si se aprecia precipitado.
• El producto esterilizado por filtración se emplea para evitar que las muestras de recuento contaminen una cámara reutilizable, no porque el propio ensayo exija esterilidad: las células teñidas se descartan.
• No devuelva al frasco original la muestra teñida sin usar.

Un frasco de 100 mL, con 20 µL consumidos por recuento, permite varios miles de recuentos, de modo que lo que suele determinar su reposición es la caducidad y no el volumen.