Albúmina humana recombinante en cultivo celular

La albúmina sérica humana es la proteína más abundante del plasma, presente a razón de unos 35-50 g/L. Estructuralmente es un único polipéptido de 585 aminoácidos con una masa molecular de aproximadamente 66,5 kDa, plegado en tres dominios helicoidales homólogos y entrecruzado por 17 puentes disulfuro, con una cisteína libre en la posición 34. No está glucosilada, lo que resulta cómodo para la producción recombinante porque elimina la necesidad de un hospedador capaz de realizar una glucosilación de tipo humano.

En cultivo celular, la albúmina desempeña varias funciones a la vez, y la confusión sobre cuál de ellas importa en una aplicación concreta es la causa habitual de decepción al sustituir una albúmina por otra.

Transportador y solubilizante. Es la función dominante. La albúmina es una proteína de transporte de uso general con múltiples sitios de unión para ácidos grasos, y con sitios adicionales para hormonas, bilirrubina, iones metálicos y una amplia variedad de moléculas pequeñas hidrófobas. En un medio definido, es la vía por la que los lípidos y otros nutrientes poco solubles se presentan a las células en una forma utilizable y no tóxica. Los ácidos grasos libres en disolución acuosa son detergentes y resultan citotóxicos; unidos a la albúmina son un nutriente.

Antioxidante y tampón de tioles. El tiol libre de la cisteína-34 es una especie reductora significativa y secuestra especies reactivas de oxígeno y radicales libres. En un medio sin suero, donde falta la capacidad antioxidante que normalmente aporta el suero, esta contribución es apreciable.

Secuestrante de especies tóxicas. La albúmina une iones de metales pesados, el exceso de ácidos grasos libres y diversos productos de peroxidación lipídica, retirando compuestos que de otro modo dañarían a las células. Esto explica en parte por qué la albúmina a menudo parece «rescatar» cultivos que crecen mal en un medio definido mínimo: está eliminando toxicidad más que aportando nutrición.

Protección frente a la cizalla y a las interfases. La albúmina es tensioactiva y se adsorbe en las interfases gas-líquido. En cultivos agitados, con burbujeo o en agitador reduce el daño derivado de la rotura de burbujas y de la cizalla hidrodinámica. También recubre las superficies plásticas y reduce la adsorción inespecífica de componentes del medio y del producto secretado, algo relevante en la práctica a concentraciones bajas de proteína y en volúmenes pequeños.

Contribución osmótica coloidal. A las concentraciones empleadas aporta una contribución modesta a las propiedades osmóticas del medio, más relevante en los procesos de perfusión y de alta densidad que en el cultivo en frasco.

Sistemas de expresión. La rHSA se produce comercialmente en levaduras —principalmente Pichia pastoris y también Saccharomyces cerevisiae— y en arroz transgénico (Oryza sativa). Los sistemas de levadura están bien establecidos: se ha descrito una expresión bajo el promotor AOX1 inducible por metanol en Pichia de 1,6 g/L en matraz agitado y de 8,86 g/L en cultivo en fermentador. La rHSA expresada en arroz se ha caracterizado ampliamente y se ha comparado tanto con la albúmina de origen plasmático como con el material expresado en levadura.

Como la albúmina no está glucosilada, todos estos sistemas pueden producir en principio una proteína con la secuencia primaria correcta y sin discrepancias de glucosilación. Las diferencias prácticas entre sistemas radican en las impurezas derivadas del hospedador, en el proceso de purificación y en las modificaciones postraduccionales que no forman parte de la proteína nativa.

Por qué usar albúmina recombinante en lugar de la obtenida de plasma:

• Sin material de donante humano. La albúmina de origen plasmático es un hemoderivado humano y arrastra el perfil de riesgo de agentes adventicios asociado, los requisitos de cribado de donantes y las limitaciones de suministro. Eliminarla de un proceso de fabricación suprime toda una categoría de evaluación del riesgo.
• Libre de origen animal y xenolibre. Para el trabajo con células madre, la terapia celular y la medicina regenerativa, y cada vez más para la fabricación de biológicos en general, la condición xenolibre es un requisito y no una preferencia.
• Estabilidad de suministro y de precio. La producción recombinante es un proceso de fermentación que responde a la demanda. El suministro de plasma no.
• Homogeneidad. Un proceso definido de fermentación y purificación es más controlable que un plasma de donantes agrupado.

Una advertencia honesta sobre la homogeneidad. «Recombinante» no significa automáticamente «invariable». La caracterización publicada de rHSA expresada en arroz procedente de varios proveedores ha documentado variabilidad entre proveedores y entre lotes en la glicación, la modificación no enzimática por azúcares durante la expresión y el procesamiento. La glicación altera las propiedades de unión y puede afectar al rendimiento. La albúmina recombinante es considerablemente más homogénea que el suero, pero sigue siendo una proteína producida por un organismo vivo, y debe someterse a ensayo por lotes en las aplicaciones exigentes exactamente igual que cualquier otra materia prima crítica.

Formatos. La rHSA se suministra habitualmente como disolución concentrada esterilizada por filtración, con frecuencia a 200 mg/mL (20 %), y también como polvo liofilizado. El formato en disolución evita el paso de reconstitución y el riesgo de formación de espuma y desnaturalización que conlleva disolver una proteína tensioactiva; el polvo ofrece una caducidad más larga a temperatura ambiente y un transporte más barato.

Intervalo habitual: 0,1-10 g/L, y la mayoría de las formulaciones sin suero emplean 0,5-5 g/L. La cifra correcta depende por completo de cuál de las funciones de la albúmina se esté aprovechando:

• Como transportador de lípidos y ácidos grasos, la concentración debe bastar para unir la carga lipídica aportada. Esto suele situarla en la región de los pocos gramos por litro.
• Como protector frente a la cizalla en cultivos agitados o con burbujeo, lo típico es 1-5 g/L, aunque a menudo se emplea junto con un tensioactivo sintético como el poloxámero 188, o en su lugar, que resulta bastante más barato para ese fin concreto.
• Como agente de bloqueo de superficies para evitar pérdidas por adsorción, bastan concentraciones mucho menores, fracciones de gramo por litro.
• Como antioxidante y secuestrante, el requisito escala con el grado de estrés del cultivo y con lo mínimo que sea el medio.

Conviene optimizarla en lugar de heredarla. La albúmina suele ser uno de los componentes más caros de un medio definido, y la concentración arrastrada de una formulación publicada es a menudo mayor de la que necesita un proceso concreto. Una titulación sencilla —tres o cuatro concentraciones a lo largo del intervalo, midiendo crecimiento, viabilidad, título del producto y calidad del producto— identifica con frecuencia un ahorro sustancial. Del mismo modo, si un medio definido rinde por debajo de lo esperado, aumentar la albúmina es una de las primeras pruebas razonables.

Preparación de disoluciones. La albúmina es tensioactiva y forma espuma con facilidad; la espuma desnaturaliza la proteína en la interfase aire-líquido. Hay que disolver el polvo espolvoreándolo sobre la superficie del líquido y dejando que se hidrate sin agitar, y mezclar después con suavidad. No se debe usar vórtex, ni agitar enérgicamente, ni burbujear una disolución en preparación.

Esterilización. Filtrar a través de 0,22 um. No autoclavar. Conviene tener en cuenta que las disoluciones de albúmina colmatan los filtros con relativa rapidez a concentraciones altas; hay que usar un filtro de tamaño adecuado y plantearse un prefiltro.

Almacenamiento. Seguir la especificación del proveedor. Las disoluciones concentradas se conservan habitualmente refrigeradas o congeladas; debe evitarse la congelación-descongelación repetida, y merece la pena alicuotar en la primera descongelación. El material liofilizado se conserva entre 2 y 8 C o por debajo y debe protegerse de la humedad.

Endotoxinas. Como la albúmina se usa en gramos por litro, su aportación de endotoxinas al medio es proporcionalmente grande. Un material con una especificación de endotoxinas incluso modesta puede dominar la carga endotóxica de un medio definido. Hay que revisar la especificación en el certificado de análisis y elegir un grado de bajo contenido en endotoxinas para células sensibles, en particular células inmunitarias primarias y células madre.

Este es el punto que más confusión genera cuando se sustituye una albúmina por otra y se obtiene un resultado distinto, y merece un tratamiento propio.

La albúmina casi nunca se suministra vacía. La albúmina nativa purificada de plasma o de suero llega con una carga sustancial de ácidos grasos y otras moléculas pequeñas unidos. La albúmina recombinante procedente de un proceso de fermentación lleva una carga distinta y en general menor. Los proveedores venden además grados explícitamente libres de ácidos grasos, preparados mediante tratamiento con carbón activo o procesos similares para retirar los lípidos unidos.

Estos grados se comportan de forma distinta, y cuál interesa depende de la tarea:

• Si la albúmina es el vehículo de aporte de lípidos, puede convenir que vaya cargada, ya sea suministrada rica en lípidos o formando complejo con una mezcla lipídica definida antes de añadirla. Muchas formulaciones sin suero combinan deliberadamente la albúmina con un concentrado lipídico químicamente definido por esta misma razón.
• Si se estudia el metabolismo de los ácidos grasos, la señalización lipídica o cualquier cosa en la que el entorno lipídico sea la variable independiente, hace falta albúmina libre de ácidos grasos. Usar una preparación cargada de lípidos supone añadir una dosis no caracterizada y variable de aquello que se pretende controlar. Esta es una fuente recurrente de falta de reproducibilidad en la investigación metabólica.
• Si la albúmina está presente únicamente para proteger frente a la cizalla o para bloquear superficies, el contenido de ácidos grasos es en gran medida irrelevante.

La regla práctica: cuando un medio se comporta de otra manera tras un cambio de albúmina, hay que revisar la especificación de ácidos grasos antes de sospechar de nada más. Dos albúminas con idéntica pureza proteica e idéntica concentración pueden sostener crecimientos bastante distintos si una está cargada de lípidos y la otra despojada de ellos. Conviene registrar el grado y el proveedor en los métodos, porque «1 g/L de albúmina» no describe adecuadamente lo que se añadió.

La misma lógica se aplica a otras especies unidas: metales y componentes residuales del proceso de purificación. Los grados tratados con carbón activo y los de bajo contenido en endotoxinas existen porque estas diferencias son reales y medibles.

La albúmina sérica bovina es la opción tradicional y mucho más económica, y para gran parte del trabajo rutinario sigue siendo perfectamente adecuada. La decisión no consiste en cuál de las dos proteínas es mejor, sino en qué exige la aplicación.

Conviene elegir rHSA cuando:

• El proceso debe ser libre de origen animal o xenolibre: terapia celular, cultivo de células madre, medicina regenerativa y, cada vez más, la fabricación de biológicos en general.
• Las células son humanas y se desea una proteína homóloga. Las diferencias entre especies en la secuencia de la albúmina y en sus propiedades de unión son reales, y las células humanas cultivadas con albúmina humana evitan la introducción de una proteína xenogénica cuyo perfil de unión difiere.
• Hay que eliminar de un proceso una vía de agentes adventicios de origen bovino, junto con su carga documental.
• La homogeneidad entre lotes importa lo suficiente como para justificar el coste. El material recombinante procedente de una fermentación controlada es en general más homogéneo que la BSA fraccionada a partir de suero bovino agrupado, aunque, como se ha señalado, no es inmune a la variación entre lotes.

La BSA sigue siendo razonable cuando:

• El trabajo es de investigación rutinaria sobre líneas establecidas, el coste importa y el origen animal no es una restricción.
• Se necesita un grado caracterizado específico —bajo en endotoxinas, bajo en ácidos grasos, libre de proteasas— que esté bien establecido en forma de BSA y validado para el ensayo en cuestión.
• Importa la continuidad histórica, por ejemplo en un estudio de larga duración en el que cambiar la albúmina introduciría un salto en los datos.

No conviene sustituir a la ligera en ninguna de las dos direcciones. La rHSA y la BSA difieren en la secuencia de aminoácidos, en las afinidades de unión por los ácidos grasos y otros ligandos, en la carga típica de ácidos grasos y en el perfil de impurezas. Un medio optimizado con una no rendirá necesariamente igual con la otra, y puede ser necesario reoptimizar la concentración. Hay que probarlas en paralelo a lo largo de varios pases, midiendo el crecimiento, la viabilidad y el criterio funcional o de producto que interese, antes de convertir un proceso.

Sobre el coste. La rHSA es sustancialmente más cara que la BSA por gramo y, a razón de gramos por litro, supone una partida importante. El planteamiento honesto es que el coste se justifica por la posición regulatoria, la condición xenolibre y la homogeneidad, no por un rendimiento superior como tal: para muchas líneas celulares en cultivo rutinario, una BSA bien elegida rinde de forma equivalente.

La albúmina es uno de los componentes del conjunto estándar de herramientas empleado para reconstruir las funciones del suero a partir de elementos definidos. Un paquete típico de suplementos sin suero incluye:

• Insulina, normalmente insulina humana recombinante, que impulsa la captación de glucosa y aminoácidos y aporta una señal de supervivencia y crecimiento.
• Transferrina, cada vez más transferrina humana recombinante, que aporta hierro en forma unida y no tóxica. El hierro es esencial y el hierro libre es un potente generador de especies reactivas de oxígeno, de modo que el mecanismo de aporte importa tanto como la cantidad.
• Selenio, en forma de selenito de sodio, cofactor de la glutatión peroxidasa y de otras selenoproteínas, que funciona como parte del sistema antioxidante.
• Albúmina, que aporta las funciones de transporte, antioxidante, secuestrante y de protección frente a la cizalla descritas más arriba.
• Lípidos definidos, suministrados típicamente como un concentrado lipídico químicamente definido, a menudo asociado a la albúmina como transportador.
• Etanolamina, precursor de fosfolípidos, incluida en algunas formulaciones.
• Un tensioactivo protector frente a la cizalla, como el poloxámero 188, para el cultivo en suspensión y en biorreactor.

Los tres primeros se suministran juntos como el ampliamente utilizado suplemento ITS, y la albúmina se añade con frecuencia junto a él. Cuando una formulación pretende ser libre de origen animal, todos los componentes deben ser recombinantes o sintéticos: un medio libre de origen animal que contenga albúmina bovina o insulina de origen porcino no es libre de origen animal, y este es un descuido frecuente al montar una formulación a partir de componentes adquiridos por separado.

Una nota práctica sobre la resolución de problemas en medios definidos. Cuando las células crecen mal en un medio definido, la tentación es añadir más de todo. Un enfoque más eficiente es comprobar las categorías por separado: ¿el problema es una señal de crecimiento ausente (probar insulina y factores de crecimiento), una función de transporte o de protección ausente (probar albúmina), un problema de aporte de hierro (probar transferrina), un problema de estrés oxidativo (probar selenio y antioxidantes) o una carencia lipídica (probar un suplemento lipídico definido)? La albúmina en particular tiende a enmascarar varios problemas subyacentes distintos a la vez, porque aborda simultáneamente la toxicidad, el aporte de lípidos y el estrés oxidativo, lo que la convierte en un instrumento diagnóstico útil cuando se añade y se retira de forma deliberada.