Suero bovino en cultivo celular

Un medio basal como el DMEM o el RPMI aporta sales, glucosa, aminoácidos y vitaminas. No aporta las señales que indican a una célula que debe crecer y, para la mayoría de las células primarias y muchas líneas establecidas, no basta por sí solo. El suero cubre esa carencia con una mezcla compleja e indefinida que contiene varios miles de proteínas distintas.

Las aportaciones funcionalmente importantes son:

• Factores de crecimiento y hormonas -- factores de crecimiento similares a la insulina, PDGF, EGF, FGF, hidrocortisona, hormonas tiroideas y otras -- que impulsan la proliferación y la supervivencia.
• Factores de adhesión, principalmente fibronectina y vitronectina, que permiten a las células dependientes de anclaje adherirse y extenderse sobre el plástico.
• Proteínas de transporte, sobre todo albúmina y transferrina. La albúmina transporta ácidos grasos, hormonas y elementos traza y tampona frente a compuestos tóxicos; la transferrina aporta hierro, que es a la vez esencial y tóxico en forma libre.
• Lípidos -- colesterol, fosfolípidos y ácidos grasos -- que muchas líneas celulares no pueden sintetizar en cantidad suficiente.
• Inhibidores de proteasas, en especial la alfa-1-antitripsina y la alfa-2-macroglobulina, que neutralizan la tripsina residual tras el subcultivo. Por eso se usa medio con suero para detener la tripsinización.
• Elementos traza y antioxidantes, incluido el selenio.
• Protección física, sobre todo en cultivo agitado o con burbujeo, donde las proteínas séricas reducen el daño por cizalla y por burbujas.

La concentración habitual es del 10% (v/v) para el trabajo rutinario, aunque muchas líneas establecidas crecen bien al 5% y algunos procesos funcionan al 2% o menos. Reducir el suero allí donde la línea lo tolera ahorra dinero, disminuye el fondo proteico de sus muestras y reduce la exposición a la variación entre lotes.

La propiedad que define al suero es que es indefinido. Nadie, ni siquiera el proveedor, sabe exactamente qué contiene un lote dado. Eso es a la vez la razón de que funcione de forma tan general y la razón de que dé tantos problemas.

El suero fetal bovino (FBS) y el suero fetal de ternera (FCS) son el mismo producto. Los dos nombres se usan indistintamente: FCS es más frecuente en Europa y FBS en América del Norte. No hay diferencia alguna en el material, y cualquier proveedor que los presente como grados distintos no está describiendo una distinción real. Esta es una de las preguntas más frecuentes sobre el suero, y la respuesta es realmente así de simple.

Los sueros bovinos se diferencian por la edad del animal, y esa diferencia determina todo lo demás:

El suero fetal bovino se obtiene del feto cuando se sacrifica para consumo una vaca gestante. Como el feto es inmunológicamente virgen y se desarrolla con rapidez, el FBS es pobre en inmunoglobulinas y complemento y rico en factores de crecimiento. Esa combinación -- fuerte promoción del crecimiento con una interferencia mínima de anticuerpos -- es la razón de que se convirtiera en la opción por defecto y de que alcance el precio más alto.

El suero de ternera recién nacida (NBCS) procede de terneros de menos de unos 20 días. Contiene más proteína total y bastante más IgG que el FBS, en gran parte de origen calostral, y menos factores de crecimiento. Es notablemente más barato y funciona bien con líneas robustas y poco exigentes.

El suero bovino de donante se obtiene de animales de entre 12 y 36 meses aproximadamente, mantenidos en un rebaño de donantes cerrado y controlado específicamente para la extracción de sangre. El rebaño controlado ofrece mejor consistencia y mejor documentación sanitaria que el material procedente de matadero.

El suero bovino adulto procede de ganado maduro y tiene el mayor contenido de inmunoglobulinas y la menor actividad promotora del crecimiento. Es el más económico y solo sirve para las aplicaciones más robustas.

Cómo elegir. No dé por hecho que necesita FBS. Muchas líneas establecidas desde hace tiempo se adaptaron históricamente al FBS y crecen perfectamente bien con suero de ternera recién nacida, a una fracción del coste y con menos presión sobre una cadena de suministro tensionada. El planteamiento correcto es ensayar: cultive su línea en paralelo con FBS y con un suero más barato durante varios pases y mida la velocidad de crecimiento, la morfología y el criterio funcional que le importe. Donde el suero más barato rinda igual, el cambio es dinero gratis. Donde no lo haga, ya sabrá por qué está pagando el FBS.

El origen geográfico importa por motivos regulatorios y no de rendimiento. Australia y Nueva Zelanda tienen el mejor estatus país frente a las encefalopatías espongiformes transmisibles y su suero se cotiza en consecuencia; los orígenes de Estados Unidos y de América del Sur también se usan mucho. Cuando el origen importa para su aplicación, debe estar documentado en el certificado de análisis y no darse por supuesto.

Esterilización por filtración. El suero se filtra a través de membranas sucesivas hasta 0.1 um, normalmente por triplicado, para eliminar bacterias y micoplasma. Se emplea un corte de 0.1 um en lugar del habitual de 0.2 um precisamente porque el micoplasma puede atravesar un filtro de 0.2 um.

Inactivación por calor: 56 °C durante 30 minutos. Esta es la condición estándar y su objetivo es estrecho: destruir la actividad del complemento dejando intactas en lo esencial las propiedades promotoras del crecimiento. El complemento es una cascada de proteínas séricas que puede lisar células cuando la activan los anticuerpos, algo relevante en los ensayos inmunológicos.

La inactivación por calor se aplica mucho más de lo necesario, en gran medida por costumbre heredada de protocolos antiguos. Es genuinamente necesaria en el trabajo sensible al complemento: ensayos inmunológicos y de citotoxicidad con anticuerpos, estudios de lisis mediada por complemento y algunos cultivos primarios de células inmunitarias. Suele ser innecesaria en el cultivo rutinario de líneas establecidas, y no sale gratis: el calentamiento degrada algunos factores de crecimiento, y el suero inactivado por calor produce de forma constante más precipitado y material floculento. Si inactiva por calor porque así lo decía el protocolo que heredó, merece la pena comprobar si supone alguna diferencia para sus células. Muchos laboratorios comprueban que no. Tenga en cuenta además que la inactivación por calor no es un paso de esterilización ni de eliminación viral; no sustituye a la filtración ni a la irradiación.

La irradiación gamma se aplica para reducir el riesgo de agentes adventicios, con procesos validados que suelen situarse en el intervalo de 25-45 kGy y reducciones descritas de 6-8 logaritmos para los virus bovinos y el micoplasma más comunes. Se realiza sobre suero congelado para limitar el daño a las proteínas. El suero irradiado es el estándar en aplicaciones con un requisito formal de seguridad viral y su uso se generaliza cada vez más. Se produce cierta pérdida de factores de crecimiento, de modo que un lote irradiado debe ensayarse en cuanto a rendimiento como cualquier otro, en lugar de suponerlo equivalente a su homólogo no irradiado.

El precipitado es normal. El material floculento o las partículas finas que aparecen en el suero descongelado son casi siempre fibrina y lipoproteína crioprecipitadas, no contaminación. Son inocuas y pueden ignorarse o eliminarse por sedimentación; no filtre usted mismo el suero para retirarlas, porque eso arrastra proteínas y arriesga contaminar un producto estéril. El suero inactivado por calor precipita más que el no tratado.

El suero varía de un lote a otro. Dos lotes del mismo proveedor, el mismo origen y el mismo grado pueden sostener velocidades de crecimiento, eficiencias de siembra y comportamientos de diferenciación apreciablemente distintos. Para una línea celular sensible o un estudio largo, esta variación es una amenaza real para la reproducibilidad: cambiar de lote de suero a mitad de un proyecto puede desplazar los resultados de un modo muy difícil de diagnosticar después.

Procedimiento de ensayo de lotes:

1. Solicite muestras. Pida al proveedor muestras de ensayo de 25-50 mL de tres a cinco lotes actuales, junto con el certificado de análisis de cada uno.
2. Ensaye en paralelo frente a su lote actual como referencia, con sus propias células, su propio medio y sus propios ensayos. Los datos del proveedor no pueden sustituir a esto, porque se generaron con otras células.
3. Mida lo que a usted le importa. Como mínimo: velocidad de crecimiento a lo largo de varios pases, eficiencia de siembra o de clonación y densidad viable final. Añada el criterio funcional del que dependa su trabajo: diferenciación, eficiencia de transfección, rendimiento vírico, título de anticuerpo, morfología. Un lote que sostiene un crecimiento rápido pero bloquea la diferenciación es un mal lote para un laboratorio de diferenciación.
4. Haga suficientes pases. Los ensayos de un solo pase pasan por alto los efectos acumulativos. De tres a cinco pases es un mínimo razonable.
5. Reserve el lote ganador. Los proveedores mantienen reservada una cantidad durante un periodo definido. Reserve lo suficiente para el proyecto o, idealmente, para un año de trabajo.
6. Solape la transición. Cuando se acabe un lote reservado, ensaye el sustituto en paralelo frente al antiguo antes de cambiar, en vez de cambiar y esperar que salga bien.

Certificado de análisis. Revíselo en lugar de archivarlo. Entradas útiles son la endotoxina (habitualmente especificada por debajo de 10 EU/mL, con grados de baja endotoxina por debajo de 1 EU/mL), la hemoglobina como indicador de hemólisis durante la extracción, la proteína total, la osmolalidad, el pH, los ensayos de esterilidad y micoplasma, los ensayos víricos y el país de origen.

Trazabilidad. La International Serum Industry Association gestiona un programa de certificación de trazabilidad destinado a documentar la cadena desde el matadero hasta el usuario final mediante auditoría independiente de terceros. Esto importa porque el etiquetado incorrecto y la adulteración del suero -- producto vendido como un grado superior o un origen más favorable del que realmente tiene -- han sido un problema documentado en este mercado, impulsado por las grandes diferencias de precio entre orígenes. Compre a proveedores que puedan documentar el origen y la cadena de custodia, y desconfíe de un lote inusualmente barato de suero de origen premium.

Almacenamiento y manipulación. Consérvelo a -20 °C. Descongélelo a 2-8 °C durante la noche, o a temperatura ambiente o 37 °C con agitación suave y periódica; no deje el suero a 37 °C durante periodos prolongados ni lo descongele a temperaturas superiores. Reparta en alícuotas en la primera descongelación en volúmenes de un solo uso, porque los ciclos repetidos de congelación y descongelación degradan el suero y generan precipitado. Protéjalo de una exposición prolongada a la luz, que degrada la riboflavina y algunos otros componentes.

De dónde procede el suero fetal bovino. El FBS es un subproducto de la industria cárnica. No se produce criando animales para obtener suero. Cuando se sacrifica para carne una vaca que resulta estar gestante, el útero y el feto se retiran en el matadero y se extrae sangre del feto, que después se procesa hasta obtener suero: se coagula, se centrifuga, se filtra y se congela. El país de origen se refiere al lugar donde tuvo lugar esa extracción. Esta sección responde a la pregunta del origen de forma directa, porque los investigadores la hacen y una página de proveedor que la esquiva no sirve como referencia.

El procedimiento de extracción. El suero fetal bovino es un subproducto de la industria cárnica. Cuando se sacrifica una vaca que resulta estar gestante, se retira el feto y la sangre se extrae por punción cardíaca del feto sin anestesiar. La cuestión central de bienestar animal es si el feto es capaz de experimentar el procedimiento. La posición científica no está cerrada, y depende de la etapa de desarrollo y de si el feto permanece inconsciente tras la separación de la circulación materna. Organismos como el NC3Rs han señalado que el proceso no está regulado de forma exhaustiva -- la Directiva 2010/63/UE relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos no cubre con claridad la extracción fetal -- y que hay pocas pruebas de que las directrices existentes estén protegiendo a los animales en la práctica. Científicos razonables sostienen opiniones distintas sobre la gravedad del problema, pero no es una polémica fabricada ni está resuelta.

El argumento de la reproducibilidad es independiente de la ética y, para muchos laboratorios, resulta más persuasivo de forma inmediata. El suero es indefinido y variable. Distintos lotes contienen concentraciones distintas de cientos de moléculas bioactivas. Los registros históricos muestran que esto se reconoció muy pronto: Puck observó que en el suero aparecen factores tóxicos en grado variable, que hay que ensayar cada lote y que el suero recogido en algunas estaciones del año había que descartarlo en una proporción elevada. Si un lote cualquiera puede cambiar el comportamiento de las células, entonces el suero es una variable no controlada situada en el centro de prácticamente todos los experimentos, y además imposible de describir de forma significativa en un apartado de métodos. "10% de FBS" no describe casi nada.

Suministro y precio. El suministro de FBS está ligado al volumen de sacrificio de vacuno y a la incidencia de gestación en el sacrificio, y ninguno de los dos responde a la demanda de las ciencias de la vida. El mercado ha sufrido subidas de precio y desabastecimientos repetidos. Para un proceso que se está escalando hacia la fabricación, esto es un riesgo de negocio real y no una simple molestia.

Dirección regulatoria. Los reguladores y los financiadores esperan cada vez más materias primas libres de origen animal en la fabricación de productos biológicos y de terapias celulares, tanto para eliminar el riesgo de agentes adventicios como para mejorar el control del proceso. Un proceso de investigación construido sobre suero acabará teniendo que rediseñarse sin él si avanza hacia la clínica, y hacerlo tarde resulta bastante más caro que hacerlo pronto.

Alternativas, valoradas con honestidad.

• Los medios químicamente definidos y sin suero son la opción más sólida allí donde existen para su tipo celular. Las líneas CHO, HEK293, de hibridoma, de insecto y muchas otras líneas de trabajo cuentan con excelentes medios comerciales sin suero y libres de origen animal, y en entornos de bioproceso estos superan de forma habitual al medio con suero en rendimiento, consistencia y purificación posterior. Para estas células, el argumento a favor del suero está esencialmente cerrado.
• Los suplementos definidos -- albúmina humana recombinante, insulina recombinante, transferrina recombinante, mezclas ITS, lípidos químicamente definidos -- reconstruyen las funciones clave del suero a partir de componentes conocidos. Así es como se construye la mayoría de las formulaciones sin suero.
• El lisado plaquetario humano (hPL) es un sustituto bien establecido del FBS en el cultivo de células estromales mesenquimales, y a menudo sostiene una expansión más rápida que el FBS. Es de origen humano y no plenamente definido, de modo que cambia un material variable por otro, pero elimina los problemas éticos y de seguridad de origen bovino y se usa en el ámbito clínico.
• La reducción del suero es un paso intermedio infrautilizado. Muchas líneas toleran el 5% o el 2% sin penalización medible. Está disponible de inmediato, no requiere trabajo de adaptación y reduce el coste y la variabilidad desde hoy mismo.

La limitación honesta. No existen alternativas sin suero para todos los tipos celulares, y la adaptación lleva tiempo y puede fracasar. Algunas células primarias y algunas líneas poco caracterizadas siguen necesitando suero de verdad, y fingir lo contrario no ayuda a nadie. La postura defendible no es que el suero no deba usarse nunca, sino que debería ser una elección deliberada para las células que lo necesitan en lugar de una opción por defecto aplicada a las que no lo necesitan; y que cualquier línea que avance hacia un trabajo escalado o clínico debería sacarse del suero tan pronto como sea practicable.

La adaptación suele ser sencilla en líneas de producción adaptadas a suspensión y más difícil en células primarias adherentes.

La adaptación secuencial es el enfoque estándar y de menor riesgo. Reduzca el suero de forma escalonada a lo largo de los pases -- por ejemplo 10%, 5%, 2.5%, 1%, 0.5%, 0% --, dejando que el cultivo recupere su tiempo de duplicación normal y una viabilidad superior al 90% antes de cada nueva reducción. Cuente con que el proceso lleve varias semanas. No pase al siguiente paso mientras el cultivo siga sufriendo.

La adaptación directa -- pasar de golpe a medio sin suero -- es más rápida y a veces funciona, sobre todo en líneas robustas en suspensión con un medio comercial bien ajustado. Mantenga en paralelo un cultivo de reserva con suero, porque el modo de fallo consiste en perder el cultivo.

Puntos prácticos:

• Banque las células antes y después. Congele viales en el punto de partida por si la adaptación fracasa, y banque la línea adaptada en cuanto sea estable. Perder una línea adaptada con éxito es un error doloroso y evitable.
• Espere una fase de crecimiento más lento. Una caída transitoria de la velocidad de crecimiento durante la adaptación es normal; una caída sostenida significa que el escalón fue demasiado grande.
• La adhesión puede cambiar. Las células adherentes que pierden el suero pierden fibronectina y vitronectina, de modo que pueden necesitar una superficie recubierta -- vitronectina recombinante, laminina o una matriz de adhesión definida -- en lugar de plástico desnudo.
• Hay que replantear la tripsinización. Sin suero no hay inhibidores de proteasas que neutralicen la tripsina, así que use un inhibidor de tripsina definido o un reactivo de disociación recombinante, y no se fíe solo de la dilución.
• La protección frente a la cizalla importa más. Los cultivos en suspensión sin suero suelen necesitar un tensioactivo como el poloxámero 188 para proteger del daño por burbujeo y agitación. La mayoría de los medios comerciales sin suero incluyen uno; compruébelo antes de darlo por hecho.
• Revalide sus ensayos. Retirar el suero cambia el fondo proteico, cambia las concentraciones libre y unida de todo lo que añada y puede cambiar la potencia aparente en un ensayo de dosis-respuesta. No compare directamente resultados sin suero con datos históricos obtenidos con suero sin comprobarlo antes.

Con suero, sin suero, libre de origen animal y químicamente definido: los términos no son intercambiables. Se usan con frecuencia de forma laxa, y las distinciones importan a la hora de especificar un proceso:

La jerarquía práctica va de medio con suero a medio sin suero, después libre de origen animal y después químicamente definido, y cada escalón aporta más control y suele costar más. Un medio puede estar libre de suero y contener aún albúmina bovina, y un medio libre de origen animal puede contener aún un hidrolizado vegetal indefinido; ambas son fuentes habituales de confusión al especificar un proceso. Consulte la referencia sobre medio químicamente definido para un tratamiento más completo de las formulaciones definidas.