Disolución de glucosa en cultivo celular

La D-glucosa (dextrosa) tiene una masa molecular de 180,16 g/mol. La conversión que sustenta todos los cálculos de esta página es, por tanto:

1 g/L de D-glucosa = 5,55 mM, y 1 mM = 0,180 g/L.

Las disoluciones madre concentradas se comercializan y se preparan a distintas concentraciones. Los porcentajes son peso por volumen:

Un ejemplo resuelto: para llevar un frasco de 1 L de DMEM bajo en glucosa (1 g/L) hasta el equivalente alto en glucosa (4,5 g/L) hay que añadir 3,5 g/L, es decir, 11,7 mL de una disolución madre de 300 g/L u 8,75 mL de una de 400 g/L.

La osmolalidad es la restricción que limita cuánto se puede añadir. La glucosa es un no electrolito, de modo que cada mol aporta aproximadamente un osmol: una disolución madre de 300 g/L se sitúa en el orden de 1700 mOsmol/kg. Añadir 10 mL de esa disolución a un litro de medio eleva la osmolalidad en torno a 17 mOsmol/kg. Una única adición es irrelevante frente a un medio situado en 260-320 mOsmol/kg. Diez alimentaciones a lo largo de un cultivo en lote alimentado de dos semanas no lo son, y el aumento progresivo de la osmolalidad por alimentaciones repetidas es una causa real y a menudo pasada por alto del descenso de viabilidad en las fases finales del cultivo. Si se alimenta de forma repetida, conviene usar la disolución madre más concentrada disponible para que el volumen añadido sea mínimo, o bien controlar la osmolalidad junto con la glucosa.

Los medios basales difieren mucho en su contenido de glucosa, y la diferencia es deliberada, no arbitraria. La glucemia humana se sitúa en torno a 5,5 mM, de modo que una formulación «baja en glucosa» es la fisiológica y la «alta en glucosa» supone entre cuatro y cinco veces el valor fisiológico.

La glucosa alta favorece una proliferación más rápida y permite prolongar el intervalo entre alimentaciones, a costa de más lactato: las células que realizan glucólisis aerobia convierten la glucosa en lactato en lugar de oxidarla por completo, y el lactato acidifica el medio. La glucosa baja limita esa carga de lactato y se acerca más al metabolismo fisiológico, a costa de requerir atención antes.

Las formulaciones sin glucosa existen por un motivo concreto y cada vez más frecuente: sustituir la glucosa por galactosa obliga a las células a depender de la fosforilación oxidativa en lugar de la glucólisis, que es la manipulación estándar para estudiar la función mitocondrial y para sensibilizar las células en ensayos metabólicos. Los medios sin glucosa son además el punto de partida de los estudios de alimentación definida en los que la glucosa es la variable en estudio.

Un medio basal está formulado para sostener un cultivo desde la siembra hasta la siguiente alimentación programada. La suplementación se justifica cuando esa premisa deja de cumplirse:

Cultivo de alta densidad y en lote alimentado. Es el caso principal. Un cultivo en lote alimentado de CHO o HEK que alcanza una densidad celular viable elevada agotará la glucosa del medio inicial bastante antes de que termine el proceso. La glucosa se aporta como parte de un suplemento de alimentación completo o como una disolución concentrada de glucosa independiente, precisamente porque se consume más rápido que el resto de los componentes y, por tanto, debe dosificarse por separado.

Cultivos prolongados entre cambios de medio. Los organoides, los protocolos de diferenciación extendidos y cualquier cultivo que quede sin atención durante un fin de semana largo pueden llegar a la limitación por glucosa. Añadir glucosa es una intervención menos agresiva que un cambio completo de medio cuando el cultivo es frágil o el calendario no permite hacerlo.

Células con alta demanda metabólica. Los hibridomas, los linfocitos activados y algunas células primarias consumen glucosa a velocidades que superan lo que aportan las formulaciones estándar.

Preparación o personalización de un medio. Al preparar medio a partir de polvo, o al trasladar un proceso a una formulación personalizada, la glucosa se dosifica como componente independiente para poder variarla sin reformular todo lo demás. Los suplementos de alimentación sin glucosa existen por la misma razón: permiten al responsable del desarrollo del proceso fijar la glucosa con independencia del aporte de aminoácidos y vitaminas.

Recuperación de un cultivo mal alimentado. Si una medición muestra que la glucosa se aproxima al agotamiento a mitad del proceso, una adición en bolo es la solución inmediata. Es una corrección, no una estrategia, y a continuación conviene revisar la estrategia.

La suplementación no se justifica por el simple hecho de que más glucosa parezca mejor. El exceso de glucosa en un cultivo que no puede utilizarla produce más lactato, no más células.

La razón por la que la alimentación con glucosa tiene literatura propia es que la cantidad de glucosa disponible cambia lo que las células hacen con ella, no solo cuánto tiempo sobreviven.

El problema del lactato. Las células en un medio rico en glucosa realizan glucólisis aerobia, convirtiendo la glucosa en lactato en lugar de oxidarla por completo, y el lactato se acumula. Los umbrales publicados varían según la línea celular y el proceso, pero la inhibición del crecimiento por encima de aproximadamente 4 g/L de lactato está ampliamente descrita en el cultivo de CHO. El lactato además arrastra el pH hacia abajo, algo que el tampón bicarbonato debe absorber y que, a su vez, obliga a añadir base en un biorreactor controlado, lo que aporta sodio y eleva aún más la osmolalidad.

Dos filosofías de alimentación. Conducen a procesos distintos:

La alimentación con glucosa suficiente mantiene la glucosa holgadamente por encima de cero, normalmente añadiendo un bolo que la devuelve a unos 6 g/L cada vez que la glucosa medida cae por debajo de unos 4 g/L, o bien mediante una alimentación controlada con una disolución concentrada de glucosa (400 g/L es una concentración de alimentación frecuentemente descrita) para mantener una consigna. Es sencilla, robusta y tolerante con un muestreo poco frecuente. También maximiza la producción de lactato.

La alimentación con glucosa limitada mantiene deliberadamente baja la glucosa residual, con un objetivo típico de 1-2 g/L mediante bolos pequeños y frecuentes cada 12-24 horas en función de la glucosa residual medida. Las células privadas de glucosa excedente se desplazan hacia el metabolismo oxidativo y, en algunos casos, empiezan a consumir el lactato que produjeron antes. Se han descrito reducciones de lactato del 60-80 % respecto a la alimentación con glucosa suficiente. El coste es que exige una medición de glucosa frecuente y exacta: el margen entre «limitada» y «agotada» es estrecho, y quedarse sin glucosa por completo hunde un cultivo.

Reglas prácticas válidas en ambos casos. Medir en lugar de suponer: la velocidad de consumo de glucosa no es constante a lo largo del proceso y aumenta bruscamente al incrementarse la densidad. Alimentar según la medición, no según el calendario. Usar la disolución madre más concentrada que resulte práctica, para reducir el volumen añadido y el aumento progresivo de la osmolalidad. Y controlar el lactato y la osmolalidad junto con la glucosa, porque la glucosa por sí sola no explicará por qué cae la viabilidad.

La glutamina es la otra mitad del cuadro. La L-glutamina se degrada espontáneamente en disolución a 37 grados C con una semivida de unos seis días, liberando amoniaco, que es tóxico. Un cultivo al que se alimenta con glucosa durante dos semanas es también un cultivo cuya glutamina lleva todo ese tiempo descomponiéndose. Para procesos de más de tres a cinco días entre cambios de medio, las formas dipeptídicas estables —L-alanil-L-glutamina o equivalente— evitan tanto la pérdida de glutamina como el amoniaco.

No se debe autoclavar la glucosa junto con aminoácidos. Los azúcares reductores reaccionan al calentarse con los grupos amino —la reacción de Maillard— y generan productos pardos y químicamente complejos, algunos de ellos citotóxicos. La glucosa además se carameliza por sí sola a las temperaturas del autoclave. Un medio autoclavado con su glucosa incorporada es un medio distinto del que figura en la hoja de formulación.

Los procedimientos correctos son, o bien esterilizar la disolución de glucosa por filtración a través de una membrana de 0,22 micras, que es lo estándar en cultivo celular y evita el problema por completo, o bien autoclavar la disolución de glucosa por separado de los componentes que contienen aminoácidos y combinarlos después en condiciones asépticas. La filtración es más sencilla y es lo que se emplea en las disoluciones estériles comerciales de glucosa.

Preparación de una disolución madre de 300 g/L. Disolver 300 g de D-glucosa de grado cultivo celular en unos 700 mL de agua de grado cultivo celular, calentando suavemente para facilitar la disolución, enrasar después a 1 L y filtrar a 0,22 micras. La glucosa concentrada es viscosa y se filtra con lentitud; un prefiltro ahorra membranas.

Almacenamiento. Las disoluciones estériles de glucosa se conservan habitualmente entre 2 y 30 grados C protegidas de la luz, con una caducidad de unos 12 meses. Los riesgos concretos son: la cristalización a concentraciones altas si la disolución se enfría, reversible calentando suavemente pero que debe redisolverse por completo antes del uso, ya que una disolución madre parcialmente cristalizada aporta menos glucosa de la calculada; y el crecimiento microbiano, porque una disolución azucarada concentrada es un excelente medio de cultivo si en algún momento se rompe la esterilidad. Una disolución madre de glucosa turbia está contaminada mientras no se demuestre lo contrario: hay que desecharla.

Endotoxinas y calidad del agua. La disolución madre de glucosa se incorpora directamente al medio en un volumen apreciable, de modo que el agua llega íntegramente a las células. Debe usarse agua de grado cultivo celular con una especificación declarada de bajo contenido en endotoxinas, sobre todo con células primarias e inmunitarias.

Consideraciones sobre el origen animal. La D-glucosa para cultivo celular se obtiene por hidrólisis de almidón y es libre de origen animal, lo que supone un elemento menos que documentar en un proceso regulado.

Agotamiento de la glucosa. El cultivo deja de crecer, la viabilidad cae y es posible que el medio no parezca especialmente ácido, porque las células también han dejado de producir lactato. Esto se previene por completo con una medición rutinaria de glucosa, y es el fallo al que se exponen las estrategias de alimentación con glucosa limitada si el muestreo no es lo bastante frecuente.

Acumulación de lactato. El crecimiento se ralentiza cuando todavía sobra glucosa, el medio amarillea deprisa y el control del pH en un biorreactor exige una adición creciente de base. La solución no es más glucosa. Es una estrategia de alimentación con glucosa limitada o una formulación basal con menos glucosa.

Aumento progresivo de la osmolalidad. Descenso tardío de la viabilidad en un proceso en lote alimentado que sobre el papel parece nutricionalmente correcto. Cada bolo de alimentación concentrada, y cada mililitro de base añadida para contrarrestar la acidificación por lactato, suma osmolalidad. Hay que medirla, no calcularla.

Amoniaco procedente de la glutamina. A menudo se atribuye a la alimentación con glucosa porque aparece en el mismo punto del proceso. La causa es la descomposición espontánea de la glutamina a 37 grados C, y la solución es una fuente estable de glutamina dipeptídica, no un cambio en el régimen de glucosa.

Pardeamiento del medio. Un tono pardo o ámbar que se desarrolla en un medio autoclavado con su glucosa, o en una disolución de glucosa sometida a un tratamiento térmico demasiado agresivo, indica productos de Maillard o de caramelización. Debe esterilizarse por filtración en su lugar.

Artefactos biológicos por glucosa alta. Las células cultivadas a 25 mM de glucosa están a una concentración cuatro o cinco veces superior a la fisiológica, lo que altera el metabolismo, la glicación y las respuestas al estrés. Si el experimento trata sobre metabolismo, señalización de la insulina, diabetes o cualquier proceso derivado de la detección de nutrientes, la concentración de glucosa es una variable experimental y debe declararse en los métodos y justificarse, no heredarse del frasco que hubiera en la estantería.