Antibióticos de selección para líneas celulares de mamífero

Los antibióticos de selección hacen justo lo contrario que la penicilina–estreptomicina de un medio de mantenimiento. Los antibióticos de cultivo se emplean a concentraciones que las células de mamífero toleran, para suprimir bacterias. Los antibióticos de selección se emplean a concentraciones que matan a las células de mamífero, para eliminar de la placa toda célula que no haya adquirido un gen de resistencia concreto.

El flujo de trabajo es siempre el mismo. El gen de resistencia se aporta en la misma construcción que el gen de interés: por transfección con plásmido, por transducción lentiviral o retroviral, o por inserción dirigida en el genoma. Unos días después se añade el agente de selección al medio. Las células que expresan el gen de resistencia sobreviven; todo lo demás muere. Lo que queda es una población policlonal resistente, que después puede clonarse a partir de una sola célula para obtener una línea estable.

Dos factores determinan si esto funciona: elegir un agente cuyo gen de resistencia esté presente en su construcción y utilizar la concentración correcta. Es en lo segundo donde fracasan la mayoría de las selecciones, y por eso la curva de mortalidad que se describe más abajo no es opcional.

Una nota sobre nomenclatura que causa confusión real al hacer pedidos: G418, Geneticina y sulfato de G-418 son el mismo aminoglucósido. La zeocina y la fleomicina D1 son el mismo glucopéptido de la familia de la bleomicina. La blasticidina y la blasticidina S son el mismo nucleósido peptidílico.

G418 / Geneticina es un aminoglucósido de Micromonospora rhodorangea. Bloquea la síntesis de polipéptidos al interferir con la función del ribosoma 80S, por lo que resulta tóxico tanto para células eucariotas como procariotas. La resistencia procede de neo (también llamado nptII), una aminoglucósido 3'-fosfotransferasa del transposón Tn5, que fosforila e inactiva el fármaco. El G418 es el más lento de los cinco: hay que contar con 7–14 días para completar la selección. Una trampa práctica: el G418 en polvo se vende con una potencia declarada en µg de fármaco activo por mg de polvo, normalmente muy por debajo de 1000 µg/mg, y varía según el lote. Las concentraciones deben calcularse sobre la base activa, no sobre el peso del polvo. Las disoluciones ya preparadas (por ejemplo, de 50 mg/mL) eliminan por completo este problema.

La higromicina B es un aminoglucósido de Streptomyces hygroscopicus que inhibe la síntesis de proteínas al alterar la translocación en el ribosoma 80S y favorecer errores de traducción. La resistencia procede de hph (también escrito hyg), la higromicina B fosfotransferasa, originaria de E. coli. El intervalo de trabajo es amplio —50–1000 µg/mL— y la selección suele tardar 7–14 días.

La blasticidina S es un nucleósido peptidílico de Streptomyces griseochromogenes que inhibe la formación del enlace peptídico tanto en ribosomas 70S como 80S. Se emplean habitualmente dos genes de resistencia: bsd, una blasticidina S desaminasa de Aspergillus terreus, y bsr, una desaminasa de Bacillus cereus. Ambos convierten la blasticidina en una forma desaminada no tóxica. La blasticidina actúa con diferencia a las concentraciones más bajas de las cinco —1–20 µg/mL, habitualmente 2–10— y mata con rapidez: los cambios morfológicos suelen verse ya a las 48 horas y la selección se completa en unos 3–10 días.

La zeocina (fleomicina D1) es un glucopéptido quelado con cobre de la familia de la bleomicina, procedente de Streptomyces verticillus. A diferencia de los otros cuatro, no actúa sobre el ribosoma: se intercala en el ADN y lo escinde, matando tanto a las células en división como a las que no se dividen. La resistencia procede de Sh ble, de Streptoalloteichus hindustanus, cuyo producto une el fármaco de forma estequiométrica y no enzimática: una molécula de proteína secuestra una molécula de fármaco. Ese mecanismo implica que la resistencia se satura, de modo que pasarse de concentración también mata a las células resistentes. Se ha descrito que la actividad de la zeocina disminuye en medios con alta concentración salina y a pH por encima de aproximadamente 7.5, así que conviene mantener el medio de selección cerca de pH 7.0–7.5 y tener presente que una selección con zeocina fallida suele ser un problema de química del medio más que de concentración. Manipúlela como un agente que daña el ADN y proteja las disoluciones de la luz.

La puromicina es un aminonucleósido de Streptomyces alboniger. Es un análogo estructural del extremo 3' del aminoacil-ARNt, por lo que entra en el sitio A del ribosoma, se incorpora a la cadena en crecimiento y provoca la terminación prematura de la cadena. La resistencia procede de pac, la puromicina N-acetiltransferasa, que la acetila y la inactiva. La puromicina es el agente más rápido —0.5–10 µg/mL, habitualmente 1–5, con muerte de las células no transfectadas en 2–4 días—, y por eso es la opción por defecto en los flujos de trabajo lentivirales, donde la velocidad importa.

En la práctica, el gen de resistencia presente en su construcción decide por usted. Cuando sí hay elección:

• Velocidad: puromicina (2–4 días) < blasticidina (3–10 días) < zeocina e higromicina B (7–14 días) ≈ G418 (7–14 días).
• Coste por litro de medio de selección: la blasticidina y la puromicina se emplean a concentraciones de microgramos por mL, de modo que, pese a su mayor precio por mg, en la práctica suelen resultar más baratas que el G418 o la higromicina B a cientos de microgramos por mL.
• Selección doble y triple: los cinco agentes tienen mecanismos y genes de resistencia distintos, por lo que se pueden combinar. Un patrón habitual es puromicina para la primera construcción y blasticidina para la segunda, ya que no hay resistencia cruzada entre ambas.
• Nivel de expresión: las comparaciones publicadas de sistemas de selección farmacológica en unas mismas células indican que la elección del marcador seleccionable puede desplazar varias veces la expresión media del transgén y modifica lo homogénea que es la expresión en el conjunto de la población. Si su ensayo requiere una expresión uniforme, merece la pena elegir el marcador de forma deliberada y no por comodidad.
• Células que no se dividen: la zeocina es la única de las cinco que mata tanto a las células que no se dividen como a las que están en división, lo que importa en cultivos primarios de ciclo lento.

Los intervalos publicados abarcan un orden de magnitud o más porque la sensibilidad varía realmente en esa medida entre tipos celulares. Las células HEK293 pueden necesitar 400 µg/mL de G418 allí donde una línea de fibroblastos primarios necesita 1000. No hay forma de acertar con esto a partir de un catálogo, y los dos modos de fallo salen igual de caros: si es demasiado baja, sobreviven células no transfectadas y aparece un fondo de células que no expresan dentro de su línea «estable»; si es demasiado alta, mata también a las células resistentes, sobre todo con la zeocina, cuya resistencia se satura.

Realice la curva de mortalidad sobre la línea parental no transfectada, en el mismo medio, a la misma densidad de siembra y en el mismo formato de placa que va a utilizar en la selección real. La densidad importa especialmente: una monocapa confluente resiste la selección mucho mejor que una dispersa, de modo que una curva de mortalidad hecha a la densidad equivocada da una respuesta que no será trasladable.

Protocolo

1. Siembre las células parentales no transfectadas en una placa de 24 pocillos, con 0.5 mL por pocillo. Para líneas adherentes utilice 0.8–3.0 × 10⁵ células/mL; para líneas en suspensión, 2.5–5.0 × 10⁵ células/mL. Busque una confluencia del 50–80% en el momento de añadir el agente, la misma densidad a la que ejecutará la selección real. Utilice pocillos por duplicado para cada concentración.
2. Deje que las células se adhieran y reanuden el crecimiento, normalmente durante la noche en el caso de las líneas adherentes.
3. Prepare una serie de diluciones del agente en medio de crecimiento completo, incluyendo un pocillo control sin antibiótico. Más abajo se detallan series ya calculadas para cada agente.
4. Sustituya el medio de cada pocillo por el medio con el antibiótico correspondiente. Trate el control sin antibiótico de forma idéntica, con cambio de medio y sin fármaco: controla la manipulación, no solo el fármaco.
5. Renueve el medio con antibiótico cada 2–3 días durante todo el periodo de selección. Este es el paso que más se omite, y omitirlo invalida la curva: los agentes se degradan en el medio a 37 °C y se acumulan restos de células muertas.
6. Examine todos los pocillos a diario al microscopio y registre el porcentaje aproximado de células muertas o desprendidas. Basta con una tabla diaria de pocillo frente a porcentaje de muerte.
7. Mantenga la curva durante la ventana de selección normal del agente: hasta 4 días para la puromicina, hasta 10 días para la blasticidina y 10–14 días para el G418, la higromicina B y la zeocina.
8. Interprete el resultado. La concentración de trabajo es la concentración más baja que mata al 100% de las células dentro de la ventana normal del agente. Si todas las concentraciones matan todo el día 2, la serie era demasiado alta: repítala con un intervalo más bajo. Si la concentración más alta deja supervivientes, amplíe el intervalo hacia arriba.
9. Confirme sobre la población resistente. Una vez que disponga de células transfectadas, compruebe que toleran la concentración elegida. Si no la toleran, el marcador está poco expresado y el problema es la construcción o el promotor, no la concentración.

Series de concentraciones ya calculadas (todas en medio de crecimiento completo, pocillos por duplicado, control sin antibiótico incluido):

• Puromicina: 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10 µg/mL. A partir de una disolución madre de 10 mg/mL, 1 µg/mL es una dilución 1:10000; prepare una dilución intermedia de trabajo de 100 µg/mL en lugar de pipetear volúmenes inferiores al microlitro.
• Blasticidina S: 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20 µg/mL. A partir de una disolución madre de 10 mg/mL, 10 µg/mL es 1:1000.
• G418 / Geneticina: 0, 100, 200, 400, 600, 800, 1000, 1500, 2000 µg/mL. A partir de una disolución de 50 mg/mL, 800 µg/mL es 1:62.5, es decir, 8 mL en 500 mL de medio.
• Higromicina B: 0, 50, 100, 200, 300, 400, 600, 800, 1000 µg/mL. A partir de una disolución de 50 mg/mL, 300 µg/mL es 1:167.
• Zeocina: 0, 50, 100, 200, 300, 400, 600, 800, 1000 µg/mL. A partir de una disolución de 100 mg/mL, 200 µg/mL es 1:500. Compruebe y registre el pH del medio, ya que la actividad de la zeocina cae por encima de pH 7.5 aproximadamente.

Repita la curva de mortalidad siempre que cambie de línea celular, de medio base, de concentración de suero o de formato de placa. La concentración de suero, en particular, desplaza el resultado, porque la proteína del suero une una fracción del fármaco.

Son dos números distintos y confundirlos provoca pérdidas evitables.

La concentración de selección es el valor obtenido en la curva de mortalidad: la dosis que elimina el 100% de las células no transfectadas. Se utiliza desde el inicio de la selección hasta que la población resistente está establecida y en expansión, normalmente durante toda la ventana de selección más unos cuantos pases.

La concentración de mantenimiento mantiene el gen de resistencia bajo la presión suficiente para evitar su silenciamiento o su pérdida, sin estresar de forma continua a una línea ya establecida. Por convención equivale a aproximadamente la mitad de la concentración de selección, y muchos laboratorios van más lejos: cultivan la línea estable ya establecida sin ningún agente y reaplican la concentración de mantenimiento durante un pase cada cuatro a seis semanas, o antes de expandir el cultivo para un experimento crítico.

Retire el agente por completo antes de los ensayos funcionales siempre que sea posible. La puromicina, a concentraciones de selección, inhibe en cierto grado la traducción en todas las células; la zeocina es un agente que daña el ADN; los aminoglucósidos afectan a la traducción mitocondrial. Ninguna de estas es una variable que interese tener dentro de una medida fenotípica.

• La concentración nunca se determinó para esta línea. Es la causa más frecuente. Un número tomado de un artículo sobre otro tipo celular en otro medio es una suposición.
• Las células estaban demasiado densas. Los cultivos confluentes resisten la selección. Repita el ensayo a la densidad que vaya a utilizar realmente.
• El medio no se renovó con suficiente frecuencia. Estos agentes se degradan a 37 °C. Cada 2–3 días, sin excepción.
• Cambió la concentración de suero. Más suero une más fármaco y eleva la concentración efectiva necesaria.
• Zeocina en el medio equivocado. Una concentración salina alta o un pH por encima de 7.5 aproximadamente reducen su actividad. Esto se parece exactamente a una dosis insuficiente.
• La selección se inició demasiado pronto. Deje pasar 24–72 horas tras la transfección o la transducción para que se exprese la proteína de resistencia antes de aplicar el agente. Aplicarlo de inmediato mata células que habrían llegado a ser resistentes.
• El marcador de resistencia se expresa mal. Si las células transfectadas mueren a una concentración que las no transfectadas sí sobreviven, sospeche de silenciamiento del promotor, de un casete truncado o de un sitio interno de entrada al ribosoma que expresa el marcador de forma débil.
• Manipulación de la disolución madre. Alicuote en la primera descongelación, almacene según las indicaciones —normalmente entre −30 y −5 °C y protegido de la luz para el G418, la blasticidina, la zeocina y la puromicina, y entre 2–8 °C para la higromicina B— y evite los ciclos repetidos de congelación–descongelación.