Medios de cultivo celular para la producción de anticuerpos monoclonales
En el día 14 de una corrida fed-batch de CHO, un medio útil se evalúa por el rendimiento medido, no por el texto del catálogo: 3.2-5.8 g/L de IgG, viabilidad de cosecha superior al 82% y lactato mantenido por debajo de 2.8 g/L después del pico de producción. Esta página de aplicación cubre medios de cultivo celular para la producción de anticuerpos monoclonales a lo largo del tren de siembra, la inoculación y la producción fed-batch de 12-16 días usando CHO-K1 (ATCC CCL-61), CHO-DG44, CHO-S y líneas de fusión de hibridoma.
Contexto del proceso — dónde encaja esto en el bioproceso
Los medios de producción de anticuerpos monoclonales deben respaldar dos funciones diferentes en el mismo proceso: expansión rápida a través del tren de siembra y, después, metabolismo controlado en el cultivo de producción.
Para procesos en suspensión con CHO-K1 (ATCC CCL-61), CHO-DG44 y CHO-S, nuestra recomendación habitual es un medio basal químicamente definido, sin componentes de origen animal, combinado con alimentaciones concentradas desde el día 3 hasta el día 12. El medio basal se libera con pH 7.21, especificación 7.00-7.40, osmolalidad 312 mOsmol/kg, especificación 260-320 mOsmol/kg, endotoxina ≤0.25 EU/mL por LAL, mycoplasma no detectado por qPCR y aprobación de esterilidad USP <71>.
Las líneas de fusión de hibridoma se manejan de forma diferente. A menudo toleran la transición sin suero más lentamente, por lo que normalmente empezamos con un medio sin suero para hibridoma más un equivalente de 2-4 mM L-glutamine y luego reducimos el arrastre de suero durante dos pasajes.
El comportamiento fed-batch está fuertemente determinado por la alimentación de aminoácidos y glucosa. En procesos CHO, una osmolalidad excesiva por encima de 380 mOsmol/kg puede aumentar qP en algunos clones mientras reduce la densidad celular viable integrada, por lo que la selección del medio debe vincularse al metabolismo del clon, no solo a la densidad celular viable máxima [1] Zhang X et al. Biotechnol Bioeng 2015;112(7):1418-1429. doi:10.1002/bit.25554.
Qué debe hacer un medio de producción de mAb (pH, osm, glucosa, glutamina, tolerancia al lactato)
El medio debe mantener el cultivo productivo después de que la fase de crecimiento se ralentiza.
| Parámetro | Objetivo de trabajo | Por qué importa |
|---|---|---|
| pH en la liberación | 7.20-7.30, lote típico 7.21 | Reduce el choque de inoculación y respalda un pH de producción controlado por CO2 de 6.95-7.15 |
| Osmolalidad | 290-330 mOsmol/kg basal, <380 mOsmol/kg después de la alimentación | Protege la viabilidad y permite la entrega de nutrientes concentrados |
| Estrategia de glucosa | 4.0-6.0 g/L en la inoculación, 1.0-4.0 g/L durante fed-batch | Limita la inanición y evita una alta acumulación de lactato |
| Equivalente de glutamina | 2-6 mM dependiente del proceso | Apoya el crecimiento sin impulsar el amoníaco por encima de 4 mM |
| Tolerancia al lactato | Mantener <3.0 g/L después del día 8 | Mejora la viabilidad en etapa tardía y la claridad de la cosecha |
Para las pruebas de liberación, el lote estándar de producción CHO sin suero incluye promoción del crecimiento en CHO-K1 (ATCC CCL-61): 95.8% de viabilidad a 96 h, 2.7 × 10^6 cells/mL y tiempo de duplicación de 22.4 h en cribado en matraz de agitación. Se usa una comprobación paralela con células permisivas HEK293T (ATCC CRL-3216) en lotes de suplementos seleccionados, con 96.3% de viabilidad a 96 h.
Los estudios fed-batch publicados muestran que la sincronización de la alimentación de glucosa y aminoácidos puede modificar el título de anticuerpo en más de un 30% sin un cambio de clon [2] Li F et al. Biotechnol Prog 2012;28(3):682-690. doi:10.1002/btpr.1533.
Nuestro conjunto recomendado, clasificado por título/viabilidad
Para un nuevo programa de mAb en CHO, empiece primero con la opción de alta viabilidad y luego evalúe la alimentación de mayor qP si el clon ya alcanza una densidad celular viable sólida.
| Clasificación | Conjunto de medios recomendado | Mejor ajuste | Resultado típico a 14 días |
|---|---|---|---|
| 1 | CCM CHO-CD Fed-Batch Base + CHO Feed A/B | CHO-K1 (ATCC CCL-61), CHO-DG44, CHO-S | título de 4.6-5.8 g/L, viabilidad de cosecha de 84-91%, VCD máxima de 15-22 × 10^6 cells/mL, qP 28-41 pg/cell/day |
| 2 | CCM CHO ADCF High-Density Medium + alimentación concentrada | Tren de siembra y producción en suspensión de alta densidad | título de 3.8-5.2 g/L, viabilidad de cosecha de 82-88%, VCD máxima de 18-26 × 10^6 cells/mL, qP 20-34 pg/cell/day |
| 3 | CCM CHO Serum-Free Transition Medium | Proyectos de reducción de suero y adaptación temprana de clones | título de 2.1-3.6 g/L, viabilidad de cosecha de 78-86%, VCD máxima de 8-14 × 10^6 cells/mL, qP 18-29 pg/cell/day |
| 4 | CCM Hybridoma SFM + paquete de suplementos | Líneas de fusión de hibridoma y cultivos de cribado de anticuerpos | 80-450 mg/L de anticuerpo, 80-90% de viabilidad en la cosecha, estabilidad de pasaje durante 6 pasajes |
La clasificación se basa primero en la productividad fed-batch y luego en la viabilidad de cosecha. Si su equipo downstream es sensible a la proteína de célula hospedadora, la carga de DNA o la carga de filtración, la condición de mayor título puede no ser la condición de menor coste.
En nuestro cribado piloto, un modelo IgG1 de CHO-K1 (ATCC CCL-61) alcanzó 5.4 g/L con el conjunto clasificado en primer lugar, con 88.6% de viabilidad en el día 14 y VCD máxima de 19.7 × 10^6 cells/mL. El mismo clon en el medio de transición alcanzó 3.0 g/L, pero facilitó la adaptación desde cultivos stock que contenían suero.
Estudio de caso con números medidos
Se realizó un estudio en tanque agitado de 2 L con un productor IgG1 CHO-K1 (ATCC CCL-61), inoculado a 0.45 × 10^6 cells/mL en CCM CHO-CD Fed-Batch Base. El cultivo utilizó una fase de crecimiento a 37 °C, cambio de temperatura a 33 °C en el día 5, oxígeno disuelto al 40% y adiciones de alimentación en los días 3, 5, 7, 9 y 11.
| Día | VCD | Viabilidad | Glucosa | Lactato | Título de IgG |
|---|---|---|---|---|---|
| 3 | 3.8 × 10^6 cells/mL | 97.2% | 2.4 g/L | 1.1 g/L | 0.18 g/L |
| 7 | 14.9 × 10^6 cells/mL | 95.1% | 1.8 g/L | 2.6 g/L | 1.92 g/L |
| 10 | 20.6 × 10^6 cells/mL | 91.4% | 2.1 g/L | 2.2 g/L | 3.84 g/L |
| 14 | 12.2 × 10^6 cells/mL | 88.6% | 1.5 g/L | 1.7 g/L | 5.42 g/L |
La qP calculada desde el día 7 hasta el día 14 fue de 36 pg/cell/day. La osmolalidad de cosecha fue de 356 mOsmol/kg y el pH final antes de la clarificación fue 7.04.
Este es el perfil que preferimos para la cualificación de compras: sin caída brusca de glucosa, consumo de lactato después de la mitad de la corrida y viabilidad superior al 85% en la cosecha. Se ha asociado un comportamiento similar de cambio de lactato con una productividad fed-batch mejorada en cultivos de mAb en CHO [3] Wahrheit J et al. J Biotechnol 2014;172:82-94. doi:10.1016/j.jbiotec.2013.12.008.
Notas de compras
Para el cribado temprano, solicite botellas de 500 mL o 1 L de medio basal más concentrados de alimentación correspondientes. Para la confirmación del proceso, la mayoría de los compradores pasan a envases de 10 L, 20 L o 50 L con un certificado de análisis específico del lote.
- Pedido inicial recomendado: 2 × 1 L CCM CHO-CD Fed-Batch Base, 1 × 250 mL CHO Feed A, 1 × 250 mL CHO Feed B y 1 × 100 mL de suplemento de productividad.
- Paquete de liberación: pH, osmolalidad, endotoxina, esterilidad, mycoplasma qPCR, apariencia y promoción del crecimiento.
- Distintivo pequeño: ENVÍO MUNDIAL GRATUITO
- Recomendación de cadena de frío: 2-8 °C para medio basal líquido, proteger de la luz, no congelar.
Solicite una reserva de lote si su campaña utiliza más de 100 L de medio basal o si la selección de clones aún está activa. Podemos reservar lotes emparejados de medio basal y alimentación durante 60-120 días, según el tamaño del envase y el calendario de fabricación.
El plazo de entrega típico es de 3-7 días hábiles para envases de investigación en stock y de 2-5 semanas para envases a granel configurados. La liberación a granel puede incluir una lectura adicional de 14 días de promoción del crecimiento celular en CHO-K1 (ATCC CCL-61) cuando se solicite antes del llenado.
Referencias
[1] Zhang X et al. Biotechnol Bioeng 2015;112(7):1418-1429. doi:10.1002/bit.25554.
[2] Li F et al. Biotechnol Prog 2012;28(3):682-690. doi:10.1002/btpr.1533.
[3] Wahrheit J et al. J Biotechnol 2014;172:82-94. doi:10.1016/j.jbiotec.2013.12.008.
[4] Kim JY et al. MAbs 2012;4(4):466-479. doi:10.4161/mabs.20432.
