Inactivación por calor del suero fetal bovino (FBS)

El complemento es una cascada de unas treinta proteínas plasmáticas que forma parte de la inmunidad innata. Cuando se activa — clásicamente por un anticuerpo unido a la superficie de una célula — la cascada avanza a través de C1, C4, C2 y C3 hasta ensamblar el complejo de ataque a la membrana, que perfora poros en la membrana diana y la lisa. Varios de los componentes iniciales, en particular C1q y C2, son termolábiles y pierden actividad en cuestión de minutos a 56 grados C. Esa es toda la base bioquímica de la práctica.

En cultivo celular, la preocupación es que el complemento residual del suero pueda lisar las células cultivadas, interferir en los ensayos basados en anticuerpos o activar las células inmunitarias que se están estudiando. En un ensayo que mide la citotoxicidad dependiente del complemento, el complemento aportado por el suplemento sérico es un factor de confusión directo, y eliminarlo no es opcional.

Hay dos cosas que la inactivación por calor no hace, y que con frecuencia se suponen erróneamente:

• No es un paso de esterilización. Treinta minutos a 56 grados C no inactivan de forma fiable los virus, y no eliminan el micoplasma. El suero se vuelve seguro mediante la esterilización por filtración a 0.1 micras durante la fabricación y, cuando se requiere, mediante irradiación gamma — no gracias al baño de agua del usuario.
• No reduce la variabilidad entre lotes. El suero inactivado por calor arrastra la misma variación entre lotes que el material sin tratar, y el calentamiento puede amplificarla, porque los componentes sensibles al calor no están presentes en la misma proporción en todos los lotes.

El modo de fallo de este procedimiento es térmico: demasiado calor o demasiado tiempo destruye los componentes del suero; poco calor o poco tiempo deja el complemento intacto. Todo lo que sigue existe para controlar la temperatura con precisión.

1. Descongele el suero despacio. Pase el frasco de -20 grados C a 2-8 grados C y déjelo toda la noche; después atempérelo a temperatura ambiente. No descongele un frasco entero directamente a 37 grados C ni en un microondas: el sobrecalentamiento local desnaturaliza proteína y produce un precipitado floculento que después se atribuye al paso de inactivación.
2. Mezcle. Invierta el frasco varias veces una vez descongelado por completo. El suero sedimenta durante el almacenamiento y un frasco sin mezclar se calienta de forma desigual.
3. Atempere a 37 grados C. Coloque el frasco en un baño a 37 grados C hasta que el contenido alcance esa temperatura. Así se acorta el tiempo de subida hasta 56 grados C, que es la parte del ciclo que no puede controlar con precisión.
4. Prepare el baño a 56 grados C. Use un termómetro calibrado y verifique el baño a 56 grados C, idealmente dentro de más menos 0.5 grados C. Muchos baños de agua se desvían 1-2 grados C. Llene el baño de modo que el nivel del agua quede por encima del nivel del suero en el frasco, y no deje nunca que el frasco descanse sobre la resistencia.
5. Prepare un control de temperatura. Ponga en el baño, junto al suero, un frasco idéntico con el mismo volumen de agua y un termómetro dentro. Es la única forma fiable de saber cuándo ha alcanzado los 56 grados C el propio suero, y no solo el baño.
6. Empiece a cronometrar cuando el control llegue a 56 grados C, no cuando entra el frasco. Un frasco de 500 mL tarda bastante en equilibrarse. Mantenga exactamente 30 minutos.
7. Agite suavemente cada 5-10 minutos. El suero es viscoso y establece gradientes térmicos; la agitación mantiene todo el volumen a temperatura y evita una capa sobrecalentada contra el vidrio. Agite con movimiento circular, no sacuda: la espuma desnaturaliza la proteína en la interfase con el aire.
8. Enfríe de inmediato. Traslade el frasco a un baño de hielo o a 2-8 grados C en cuanto se cumplan los 30 minutos. Dejarlo enfriar despacio en la mesa añade una dosis extra de calor no controlada.
9. Reparta en recipientes estériles en volúmenes de un solo uso, trabajando en condiciones asépticas en una cabina de seguridad biológica. Dividir un frasco de 500 mL en alícuotas de 50 mL evita los ciclos repetidos de congelación y descongelación y evita la tentación de recalentar un frasco a medio usar.
10. Consérvelo a -20 grados C, protegido de la luz. Etiquételo con claridad como inactivado por calor, con la fecha. No inactive nunca dos veces por calor: un segundo ciclo duplica aproximadamente el daño térmico sin ningún beneficio adicional.

Nota sobre el escalado: si trata varios frascos, no sature el baño. Cada frasco adicional ralentiza la recuperación del conjunto del baño hasta 56 grados C y alarga la fase de subida no controlada.

La cifra es empírica e histórica. Procede de la serología clásica, donde se estableció que 56 grados C durante 30 minutos bastaban para abolir la actividad hemolítica del complemento en sueros humanos y animales dejando las inmunoglobulinas prácticamente intactas. Cuando el cultivo de células de mamífero adoptó la suplementación con suero, heredó esa convención serológica sin más.

La convención no se estableció mediante un ensayo comparativo en cultivo celular, y nunca se ha optimizado con ese fin. Es un umbral que destruye el complemento de forma fiable, no un ajuste que se haya demostrado óptimo para las células en cultivo. Esa distinción importa, porque esos mismos 30 minutos a 56 grados C actúan también sobre todo lo demás que hay en el suero.

Existe un conjunto real, aunque estrecho, de aplicaciones en las que el complemento del suplemento sérico es un interferente activo y debe eliminarse:

• Ensayos de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Toda la lectura es la lisis mediada por complemento, aportado deliberadamente desde una fuente definida. Cualquier complemento que llegue con el suplemento sérico corrompe la línea basal.
• Ensayos inmunológicos y cultivo de células inmunitarias. Ensayos de proliferación y activación de linfocitos, reacciones linfocitarias mixtas y, en general, el cultivo primario de células inmunitarias, donde los componentes del complemento pueden activar o lisar las células en estudio.
• Cultivo de hibridomas y trabajo con anticuerpos monoclonales. Es práctica habitual de laboratorio, tanto por el origen inmunitario de las células como porque el complemento puede interferir en las lecturas posteriores basadas en anticuerpos.
• Tipos celulares primarios y diferenciados sensibles al complemento. Una minoría de líneas sí crece mejor con suero inactivado por calor. Coriell describe que, tras pasar a suero estándar, observó que un pequeño subconjunto de líneas diferenciadas rendía mejor con material inactivado por calor, aunque esto era poco frecuente.
• Trabajo de neutralización vírica en el que el complemento pueda contribuir a la neutralización o a la lisis de células infectadas, y falsear un título.

Si su protocolo entra en una de estas categorías, inactive por calor — o compre suero preinactivado, que se fabrica con un control de temperatura mejor del que alcanza un baño de agua de laboratorio.

Para el mantenimiento rutinario de líneas celulares establecidas, los datos no respaldan la inactivación por calor como opción por defecto.

La actividad del complemento en el suero fetal bovino ya es baja de partida. Triglia y Linscott encontraron que los niveles de los componentes del complemento en FBS comercial eran una fracción de los del bovino adulto, y que en diez muestras comerciales de FBS no se detectaba hemólisis ni siquiera en suero sin diluir. Los terneros fetales no han acumulado la exposición inmunitaria que genera un título de complemento adulto, y el suero se empobrece aún más durante el procesado y la filtración.

La vía del complemento necesita además anticuerpos para arrancar. La vía clásica se dispara por complejos antígeno-anticuerpo. En un cultivo estándar de una línea establecida en suero bovino, ese disparador está en gran medida ausente.

La manipulación habitual ya inactiva buena parte de lo que queda. El suero se descongela y se atempera de forma rutinaria a 37 grados C antes de usarlo, y los componentes iniciales del complemento son lo bastante lábiles como para que solo esa manipulación reduzca sustancialmente la actividad.

La experiencia directa a gran escala coincide. Coriell pasó de suero fetal bovino inactivado por calor a suero estándar en sus colecciones y comunicó que la inactivación por calor no es necesaria para la mayoría de las líneas celulares. Las líneas robustas de trabajo — HEK293, CHO, NIH/3T3 y líneas de fibroblastos comparables — no muestran ningún beneficio.

El resumen honesto es que la inactivación por calor es un paso heredado en la mayoría de los protocolos. Persiste porque está escrita en los procedimientos normalizados de trabajo del laboratorio, porque resulta cómodo mantener un solo inventario de suero y porque nadie quiere ser quien cambió una variable en un sistema de cultivo que funciona.

Treinta minutos a 56 grados C no son una operación selectiva. Eliminan el complemento y actúan también sobre el resto del proteoma del suero.

Pérdida de factores de crecimiento lábiles. El suero sostiene el crecimiento gracias a una mezcla mal definida de factores de crecimiento, hormonas, factores de adhesión y proteínas transportadoras, algunos de ellos sensibles al calor. Una temperatura demasiado alta o una exposición demasiado larga destruye parte de ellos, que es precisamente el motivo de que las tolerancias del protocolo sean estrechas. La consecuencia práctica suele verse como una menor eficiencia de siembra y una menor eficiencia de clonación, más que como un cambio en la velocidad global de crecimiento: las células a baja densidad son las que más dependen de los componentes lábiles.

Proteoma sérico alterado. El calentamiento desnaturaliza y agrega una fracción de la proteína sérica. Para el trabajo proteómico y metabolómico esto es un problema directo: los perfiles analíticos de células cultivadas en suero inactivado por calor difieren de los de células cultivadas en suero sin tratar, y la diferencia es un artefacto del suplemento.

Interferencia en el trabajo con vesículas extracelulares. Se ha demostrado que el tratamiento térmico altera los perfiles proteicos de las células productoras de vesículas extracelulares, lo que convierte al suero inactivado por calor en una mala elección para los estudios de aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares. Este trabajo requiere en general suero libre de vesículas extracelulares, obtenido por ultracentrifugación o filtración de flujo tangencial, que es un producto distinto del suero inactivado por calor.

Precipitado y turbidez. La agregación proteica durante el calentamiento produce material floculento o una turbidez general. No es contaminación, pero enturbia el medio, puede confundirse con una contaminación y añade partículas que acaban sobre la superficie de cultivo. Descongelar en exceso antes del proceso y sobrecalentar durante él empeoran ambos el resultado.

Tiempo y coste. El procedimiento ocupa un baño de agua y a un operador durante casi una hora por lote, y es una manipulación aséptica manual de un reactivo caro, con el riesgo de contaminación que eso implica.

Precipitado abundante o una capa gelatinosa después de la inactivación. El suero se sobrecalentó: o el baño se pasó de temperatura, o el frasco descansaba sobre la resistencia, o el cronómetro se puso en marcha antes de que el suero alcanzara la temperatura y en la práctica se mantuvo más de 30 minutos. El precipitado fino puede retirarse filtrando por 0.22 micras, aunque eso cuesta algo de proteína. La prevención consiste en un baño calibrado, un frasco de control lleno de agua y un nivel de agua suficiente.

El suero rinde peor que el lote sin tratar al que sustituye. Sospeche una sobredosis térmica. Compare la eficiencia de siembra y la eficiencia de clonación, no solo la confluencia a las 72 horas: esos son los criterios más sensibles a la pérdida de factores lábiles.

Todavía se detecta actividad del complemento. El suero nunca llegó a 56 grados C. Es el resultado típico de arrancar el cronómetro cuando el frasco entra en el baño en lugar de cuando el contenido alcanza la temperatura, y es frecuente con frascos de 500 mL.

Espuma y proteína desnaturalizada en la superficie. El frasco se sacudió en lugar de agitarse con movimiento circular. Las proteínas séricas se desnaturalizan con facilidad en la interfase aire-líquido.

Medio turbio tras la suplementación. Suele ser precipitado arrastrado. Mire el frasco de suero al trasluz antes de usarlo; fíltrelo si es necesario.

Inconsistencia entre lotes según el operador. Cargas distintas del baño, tamaños de frasco distintos y convenciones de cronometraje distintas producen productos genuinamente distintos. Si un laboratorio va a inactivar por calor, el procedimiento necesita un procedimiento normalizado de trabajo escrito que especifique el frasco de control y la regla de inicio del cronómetro; de lo contrario, "inactivado por calor" no es un tratamiento definido.

Estos tres tratamientos se confunden a menudo en las decisiones de compra, y hacen trabajos completamente distintos.

La esterilización por filtración a través de una secuencia de membranas que termina en 0.1 micras es el paso de fabricación que hace al suero microbiológicamente seguro para el cultivo. Elimina bacterias y hongos, y la filtración a 0.1 micras reduce sustancialmente el micoplasma. No es opcional y no es algo que realice el usuario.

La irradiación gamma es un paso de reducción vírica que aplica el fabricante al suero congelado a una dosis validada. Va dirigido a los agentes víricos adventicios que la filtración no puede eliminar. Se emplea cuando la aplicación posterior es biofarmacéutica o cuando la exigencia regulatoria requiere una reducción vírica documentada. La irradiación tiene su propio pequeño coste en rendimiento del suero.

La inactivación por calor no es ninguna de las dos cosas. Es un tratamiento funcional dirigido a una clase de proteínas, realizado por el usuario o suministrado ya tratado, y no aporta nada apreciable a la seguridad microbiológica ni vírica.

El corolario es que la mención "inactivado por calor" en una etiqueta responde a una pregunta sobre el complemento, y no responde nada sobre la esterilidad. Si la preocupación son los agentes adventicios, lo que hay que mirar en la especificación es el tren de filtración, el estado de irradiación gamma y la documentación de país de origen y trazabilidad — no el tratamiento térmico.