Medio de congelación celular y protocolos de criopreservación

La congelación mata las células de dos maneras distintas, y la criopreservación es un compromiso entre ambas.

Hielo intracelular. Si el enfriamiento es rápido, el agua del interior de la célula no tiene tiempo de salir antes de congelarse. Se forman cristales de hielo dentro del citoplasma y, al crecer, desgarran mecánicamente las membranas y los orgánulos. Esto es prácticamente siempre letal.

Efectos de la disolución. Si el enfriamiento es lento, el agua extracelular se congela primero y deja la disolución no congelada restante progresivamente más concentrada. La célula pierde agua por ósmosis hacia esa disolución concentrada y se contrae, y queda expuesta durante un periodo prolongado a concentraciones de soluto muy altas, a valores extremos de pH y a una fuerza iónica alterada. Esto también resulta lesivo.

Entre ambos extremos se sitúa una velocidad de enfriamiento óptima que depende del tipo celular: es función de la permeabilidad de la membrana al agua y de la superficie de la célula en relación con su volumen. Para la mayoría de las células de mamífero ese óptimo se acerca a 1 C por minuto, motivo por el cual esa cifra aparece en casi todos los protocolos.

Qué hace un crioprotector. Un crioprotector penetrante como el DMSO o el glicerol entra en la célula y reduce el punto de congelación, disminuye la fracción de agua que se convierte en hielo a cualquier temperatura dada y modera el aumento de la concentración de solutos a medida que avanza la congelación. Amplía la ventana entre los dos mecanismos letales, de modo que una velocidad de enfriamiento practicable pasa a ser compatible con la supervivencia. No impide la congelación: cambia lo que la congelación hace.

Los crioprotectores no penetrantes, como la trehalosa, la sacarosa y diversos polímeros, actúan fuera de la célula controlando la estructura del hielo extracelular y deshidratando la célula de forma más gradual y controlada. Las formulaciones definidas modernas combinan con frecuencia ambas clases.

Las formulaciones clásicas, todas ellas todavía muy utilizadas:

• 90 % de suero fetal bovino + 10 % de DMSO. La opción tradicional, y todavía la más robusta para muchas líneas adherentes establecidas. Las proteínas del suero aportan protección adicional frente al estrés osmótico y mecánico durante las transiciones.
• Medio de crecimiento completo + 10 % de DMSO. Más sencillo y más barato, y suficiente para muchas líneas. La recuperación tras la descongelación suele ser algo menor que con las formulaciones ricas en suero.
• 50 % de medio completo + 40 % de FBS + 10 % de DMSO. Un término medio frecuente.
• Medio condicionado más medio fresco más DMSO, usado para células de insecto y algunas células en suspensión, donde el medio condicionado por las propias células mejora la recuperación.

Concentración de DMSO: 5-10 %. El diez por ciento es el punto de partida estándar y funciona para la mayoría de las líneas celulares de mamífero. El cinco por ciento suele ser igual de eficaz y menos tóxico, y merece la pena probarlo en cualquier línea que se congele de forma rutinaria, en particular con células primarias sensibles, células madre y células que vayan a descongelarse directamente para un ensayo delicado. Las concentraciones superiores al 10 % rara vez son beneficiosas y aumentan la toxicidad. Las concentraciones inferiores a aproximadamente el 5 % ofrecen en general una protección pobre para las células de mamífero.

El glicerol se emplea al 5-10 % como crioprotector penetrante alternativo. Penetra en las células más lentamente que el DMSO, por lo que requiere un equilibrado más largo, pero es menos tóxico a temperatura ambiente y no comparte los efectos inductores de diferenciación del DMSO. Es el crioprotector estándar para bacterias y levaduras, y constituye una opción real para las células de mamífero que responden mal al DMSO. No es un sustituto directo: hay que probarlo antes de cambiar el método para una línea valiosa.

Densidad celular. Congelar a 1 x 10^6 a 1 x 10^7 células/mL, con 1-5 x 10^6 células/mL como valor típico en las líneas rutinarias. Congelar a una densidad demasiado baja da mala recuperación, ya que las células se recuperan mejor a partir de un inóculo razonablemente denso. Un vial estándar contiene 1-1,8 mL.

La calidad del cultivo de partida importa más que la formulación. Las células deben estar en crecimiento en fase logarítmica, sanas y con una viabilidad superior al 90 % antes de congelarlas. Un cultivo confluente, sobrecrecido, sometido recientemente a estrés o ya en declive se congelará mal por buen medio que se emplee. Este es el factor que más determina la recuperación tras la descongelación y el que más a menudo se descuida.

Preparar el medio de congelación en el momento y mantenerlo frío. El DMSO desprende calor al mezclarse con disoluciones acuosas, así que conviene prepararlo con antelación y enfriarlo a 2-8 C antes de añadir las células.

Hay que trabajar deprisa una vez añadido el DMSO: es tóxico para las células a temperaturas por encima de la congelación, y el tiempo de contacto a temperatura ambiente debe minimizarse.

Preparación

1. Preparar el medio de congelación con antelación y enfriarlo a 2-8 C. Etiquetar los crioviales con la línea celular, el número de pase, la fecha, el número de células y el operador antes de empezar; escribir sobre viales ya escarchados no es fiable.
2. Confirmar que el cultivo está sano y en fase logarítmica, no confluente, y con una viabilidad superior al 90 % mediante recuento con azul de tripano.

Cosecha

3. Cosechar las células adherentes con tripsina-EDTA, usando la digestión mínima necesaria, y neutralizar de inmediato. Las células sobretripsinizadas se congelan mal.
4. Centrifugar con suavidad —normalmente 200-300 x g durante 5 minutos— y retirar el sobrenadante por completo.
5. Contar y determinar la viabilidad. Registrar el recuento previo a la congelación; hará falta al interpretar la recuperación tras la descongelación.

Resuspender y llenar

6. Resuspender el sedimento en medio de congelación frío a 1-5 x 10^6 células/mL. Resuspender con suavidad y por completo, evitando burbujas.
7. Dispensar 1-1,8 mL por criovial, mezclando la suspensión periódicamente para que los últimos viales contengan la misma densidad que los primeros. Las células sedimentan deprisa.
8. Algunos protocolos permiten un breve equilibrado de unos 10-15 minutos para que el DMSO penetre; otros pasan directamente al enfriamiento. Ambas opciones son defendibles, pero no debe dejarse a las células en DMSO a temperatura ambiente durante periodos prolongados.

Enfriar a velocidad controlada

9. Trasladar los viales a un recipiente de enfriamiento a velocidad controlada —con camisa de isopropanol o un enfriador pasivo de diseño específico— y colocarlo en un congelador a -80 C. Estos dispositivos proporcionan aproximadamente -1 C por minuto, lo que se ajusta a la mayoría de las células de mamífero.
10. Dejarlo toda la noche, o un mínimo de unas 4 horas.
11. Para material de alto valor, trabajos de terapia celular o células con velocidades óptimas inusuales, usar un congelador programable de velocidad controlada, que ofrece un perfil reproducible y documentado y permite aplicar una etapa de nucleación de hielo controlada.

Traslado al almacenamiento a largo plazo

12. Pasar los viales a la fase de vapor del nitrógeno líquido sin demora, en un plazo de 24-72 horas. No deben dejarse en el congelador a -80 C como almacenamiento a largo plazo.
13. Registrar la ubicación exacta en el inventario en el mismo momento del traslado.

Verificar

14. Descongelar un vial al cabo de 24-48 horas y comprobar la viabilidad y la recuperación. Un banco que nunca se ha comprobado no es un banco. Hay que hacerlo antes de descartar el cultivo original.

El almacenamiento a largo plazo exige temperaturas por debajo de aproximadamente -135 C. Esa es la temperatura de transición vítrea de la fase acuosa residual. Por encima de ella, las moléculas de agua conservan movilidad suficiente para que el hielo recristalice lentamente: los cristales pequeños se fusionan en otros mayores con el tiempo, y los cristales crecientes dañan las células. Por debajo de ella, la disolución es en la práctica un vidrio y el movimiento molecular se detiene esencialmente, de modo que las células pueden conservarse de forma indefinida.

Un congelador a -80 C está por encima de ese umbral. Las células conservadas a -80 C pierden viabilidad de forma progresiva: suele ser tolerable durante semanas o unos pocos meses, y poco fiable más allá. Usar -80 C como almacenamiento a largo plazo es un error frecuente y caro: la pérdida es silenciosa y solo se descubre cuando un vial irremplazable no se recupera años después.

El almacenamiento en nitrógeno líquido proporciona -196 C en la fase líquida y habitualmente de -150 C a -190 C en la fase de vapor, ambas holgadamente por debajo del umbral.

La fase de vapor es preferible a la fase líquida por dos razones. Primera, el nitrógeno líquido puede filtrarse en crioviales imperfectamente sellados; al calentarse, el nitrógeno atrapado se expande violentamente y los viales pueden reventar, lo que supone un riesgo real de lesión al retirar una gradilla. Segunda, el nitrógeno líquido puede transferir contaminación entre viales, y existen incidentes documentados de contaminación cruzada en el almacenamiento en fase líquida. La fase de vapor evita ambas cosas. Si se emplea la fase líquida, hay que usar viales homologados para ella o sobreenvolverlos.

Disciplina práctica de almacenamiento:

• Repartir el banco entre dos recipientes, idealmente en salas distintas o en circuitos de alarma distintos. El fallo de un solo congelador nunca debería poder destruir una línea.
• Vigilar con alarmas el nivel de nitrógeno y la temperatura, con una vía de escalado fuera del horario laboral que atienda una persona real.
• Mantener un inventario escrito independiente de cualquier ordenador concreto, y actualizarlo en el momento del depósito y no después.
• Minimizar el tiempo fuera del almacenamiento. Hay que trabajar deprisa al recuperar viales y mantener las gradillas por debajo del cuello del recipiente. El recalentamiento breve y repetido de los viales vecinos los degrada.
• Usar pantalla facial y guantes criogénicos al manipular viales almacenados.
• Crear el banco en dos niveles: un banco maestro de pase bajo que se toca en contadas ocasiones y un banco de trabajo derivado de él para el uso rutinario.

La descongelación invierte la lógica de la congelación: enfriar despacio, descongelar deprisa. Un calentamiento lento permite que los cristales de hielo pequeños recristalicen en otros grandes y dañinos, de modo que atravesar la transición con rapidez resulta protector.

1. Preparar todo antes de recuperar el vial. Atemperar el medio de crecimiento completo a 37 C y tener listo un frasco o un tubo etiquetado. El vial debe permanecer fuera del almacenamiento el menor tiempo posible.
2. Recuperarlo con pantalla facial y guantes criogénicos. Transportarlo en un recipiente pequeño con hielo seco o nitrógeno líquido si el trayecto dura más de unos segundos.
3. Descongelar rápidamente en un baño de agua a 37 C, durante 1-2 minutos, agitando con suavidad. Mantener el tapón por encima del nivel del agua para no contaminar la rosca. Detenerse cuando aún quede un pequeño cristal de hielo: no hay que calentar el vial hasta los 37 C. Un vial totalmente descongelado dentro del baño son células en DMSO a 37 C, que es exactamente lo que se pretende evitar.
4. Descontaminar el exterior del vial con etanol al 70 % antes de abrirlo en la cabina.
5. Diluir despacio. Pasar el contenido a un tubo y añadir medio atemperado gota a gota al principio y después más deprisa, hasta unas diez veces el volumen del vial. Añadir el medio deprisa provoca choque osmótico: la célula está cargada de DMSO y una dilución brusca de la disolución externa hace entrar agua rápidamente. Este paso es la causa más frecuente de mala recuperación a partir de un vial correctamente congelado.
6. Eliminar el DMSO. O bien centrifugar suavemente a 200-300 x g durante 5 minutos y resuspender en medio fresco, o bien —en el caso de células sensibles a la cizalla— sembrar directamente en un volumen mayor y cambiar el medio a las 4-24 horas, una vez que las células se hayan adherido. Ambas opciones son aceptables: la centrifugación elimina el DMSO más deprisa, y la siembra directa evita un paso de centrifugación en células frágiles.
7. Sembrar a una densidad generosa. Los cultivos recién descongelados se recuperan mejor si están densos. No conviene repartir un vial recién descongelado entre varios frascos.
8. Evaluar. Comprobar la adhesión y la morfología a las 24 horas. Cabe esperar una viabilidad superior al 80-90 % tras la descongelación en un banco bien preparado de una línea establecida, aunque las células primarias y sensibles suelen dar valores más bajos.
9. Dejar que el cultivo se recupere antes de usarlo. Hay que dar a las células al menos dos o tres pases para que vuelvan a su tiempo de duplicación y a su morfología normales antes de emplearlas en un experimento. Las células recién descongeladas no son fisiológicamente normales, y los resultados obtenidos con ellas resultan con frecuencia irreproducibles.

La formulación clásica de 90 % de FBS más 10 % de DMSO contiene precisamente los dos ingredientes de los que el cultivo celular moderno intenta alejarse.

Medios de congelación sin suero y libres de origen animal. Si una línea se ha adaptado al crecimiento sin suero, congelarla en un 90 % de suero es incoherente: reintroduce el material que se había eliminado, impone una exposición al suero en cada ciclo de creación de banco y descongelación, y devuelve la variabilidad entre lotes al paso de recuperación. Los medios de congelación definidos y sin suero son una tecnología madura, están ampliamente disponibles y rinden de forma comparable a las formulaciones con suero en la mayoría de las líneas adaptadas. Para cualquier proceso que avance hacia la fabricación, un medio de congelación libre de origen animal es en la práctica obligatorio, ya que un componente de origen bovino en el banco celular plantea un problema regulatorio y de agentes adventicios con independencia de lo que contenga el medio de producción.

Las formulaciones de alta densidad existen para crear bancos a concentraciones celulares elevadas, algo que importa cuando un único vial debe sembrar un cultivo grande o cuando el espacio de almacenamiento es limitado.

Reducir o eliminar el DMSO. El DMSO tiene inconvenientes reales más allá de su toxicidad aguda:

• Induce diferenciación en algunas líneas celulares, un efecto bien documentado que en ciertos sistemas se aprovecha deliberadamente y en otros constituye un factor de confusión indeseado.
• Tiene efectos documentados sobre la expresión génica y las marcas epigenéticas, algo preocupante en células madre y en cualquier trabajo cuyo objeto sea el estado epigenético.
• En la fabricación de terapias celulares existe un interés sostenido por reducir o eliminar el DMSO del producto final, y reducirlo aligera la carga de los pasos de lavado posteriores.

Las disoluciones de criopreservación químicamente definidas y sin DMSO están disponibles comercialmente y suelen combinar azúcares no penetrantes como la trehalosa o la sacarosa con polímeros y otros agentes protectores, a veces junto con un agente penetrante de baja toxicidad. El rendimiento depende del tipo celular: algunas líneas se congelan en ellas igual de bien que en DMSO, mientras que otras se recuperan de forma apreciablemente peor. Son una opción real más que un sustituto universal, y el enfoque correcto es probarlas sobre la propia línea en paralelo con el método actual antes de comprometer un banco.

Cómo evaluar cualquier medio de congelación nuevo:

1. Congelar viales equiparados con la formulación actual y con la candidata, a partir de la misma cosecha, a la misma densidad y con el mismo perfil de enfriamiento.
2. Conservar ambos durante un intervalo significativo —al menos una semana, preferiblemente más—, ya que algunas diferencias solo aparecen tras un almacenamiento prolongado.
3. Descongelar en paralelo y comparar la viabilidad inmediata tras la descongelación, la adhesión a las 24 horas, el tiempo hasta recuperar la duplicación normal y el criterio funcional del que depende el trabajo.
4. Solo entonces convertir el banco, y conservar viales de la formulación antigua hasta que la nueva haya demostrado su valor a lo largo de un ciclo completo.