Trypsin-EDTA

La tripsina es una serina proteasa. En el páncreas digiere las proteínas de la dieta; en cultivo celular hace el mismo trabajo con las proteínas que unen la célula a sus vecinas y al plástico. Corta enlaces peptídicos específicamente por el lado carboxilo de los residuos de lisina y arginina, que son lo bastante frecuentes en las proteínas de adhesión como para que unos pocos minutos de exposición basten para liberar una monocapa.

La tripsina usada en cultivo celular suele ser tripsina pancreática porcina bruta, suministrada como polvo irradiado y especificada por una designación de actividad y no por una pureza: 1:250 significa que una parte del polvo digerirá 250 partes de caseína en condiciones definidas. No es un grado de pureza, y una preparación 1:250 contiene otras proteasas pancreáticas además de la tripsina. Esa mezcla explica en parte por qué la tripsina bruta funciona bien en tejido primario resistente y por qué es más agresiva con células delicadas que una enzima purificada o recombinante.

El EDTA está en la formulación por una razón concreta que conviene entender más que memorizar. Los principales sistemas de adhesión celular dependen de cationes divalentes. Las cadherinas, que median la adhesión célula-célula, necesitan calcio para mantener sus dominios extracelulares en la conformación rígida que permite la unión; si se retira el calcio, los dominios se vuelven flexibles y la adhesión falla. Las integrinas, que median la adhesión al sustrato, necesitan cationes divalentes en su sitio de adhesión dependiente de iones metálicos. El EDTA quela el calcio y el magnesio e inutiliza ambos sistemas.

Hay un segundo efecto, menos evidente. Los cationes divalentes de la matriz extracelular protegen físicamente los enlaces peptídicos a los que la tripsina necesita llegar. Al retirarlos, esos sitios quedan expuestos. Así pues, el EDTA no solo debilita la adhesión en paralelo a la tripsina: hace que la propia tripsina sea más eficaz. Esta sinergia explica por qué el Trypsin-EDTA actúa más rápido y con menos enzima que la tripsina sola.

La misma lógica explica el tercer componente en el que quizá no había pensado: la solución base siempre está libre de calcio y magnesio. El Trypsin-EDTA se formula en HBSS o PBS sin Ca/Mg precisamente para que el tampón no reponga los iones que el EDTA acaba de retirar. Lavar una monocapa con un PBS que contenga calcio justo antes de tripsinizar echa por tierra ese diseño.

El porcentaje se refiere al contenido de tripsina en peso por volumen. El 0.05% son 0.5 g/L; el 0.25% son 2.5 g/L, cinco veces más enzima.

El Trypsin-EDTA al 0.05% es la opción de rutina para la mayoría de las líneas celulares adherentes establecidas —HeLa, CHO, Vero, NIH-3T3, MDCK y similares— y para todo aquello que quiera tratar con suavidad. El producto al 0.05% de Gibco se formula con 0.5 g/L de tripsina (1:250) y 0.2 g/L de EDTA-4Na en HBSS sin calcio ni magnesio con rojo de fenol.

El Trypsin-EDTA al 0.25% se usa para células que se resisten a despegarse: líneas firmemente adheridas, células que han superado la confluencia y han depositado abundante matriz extracelular, algunos cultivos primarios y fragmentos de tejido. El producto al 0.25% de Gibco contiene 2.5 g/L de tripsina (1:250) con 0.38 g/L de EDTA-4Na en la misma base. El equivalente de Sigma usa 2.5 g/L de tripsina porcina con 0.2 g/L de EDTA-4Na en HBSS con rojo de fenol; es decir, el contenido de EDTA varía entre proveedores, aproximadamente en el intervalo de 0.4-0.9 mM, y no es una cifra normalizada.

La regla práctica es usar la concentración más baja y el tiempo más corto que liberen las células. Más enzima no es la solución a un despegue lento; suele ser el síntoma de alguno de los problemas que se enumeran más abajo (arrastre de suero, reactivo frío, calcio en el lavado). Unas células que necesitan un 0.25% durante diez minutos son unas células a las que está dañando.

Algunos laboratorios mantienen una solución madre al 0.25% y la diluyen en PBS sin Ca/Mg para preparar el 0.05% según lo necesiten. Funciona, sale más barato y es perfectamente aceptable siempre que el diluyente sea estéril y esté libre de calcio. Tenga en cuenta que diluir la tripsina también diluye el EDTA, lo que cambia el equilibrio del reactivo.

La tripsina sin EDTA existe y tiene usos reales: trabajos en los que quelar los cationes divalentes alteraría la biología que se estudia, y aplicaciones en las que el arrastre de EDTA envenenaría una enzima posterior dependiente de cationes divalentes. Despega las células más lentamente que el reactivo combinado.

Con rojo de fenol o sin él es una decisión de formulación, no funcional. El rojo de fenol facilita ver el reactivo y detectar problemas de pH; se omite en trabajos de fluorescencia donde su fondo importa, y en aplicaciones posteriores en las que cualquier colorante resulta indeseable.

La mayoría de los laboratorios compran el Trypsin-EDTA ya preparado, pero prepararlo a partir del polvo sale más barato a gran volumen y es la única opción cuando se necesita una formulación que nadie vende. Las formulaciones publicadas de Gibco son la referencia que hay que reconstruir.

Trypsin-EDTA al 0.25%, por litro

Para el Trypsin-EDTA al 0.05% use 0.5 g del mismo polvo por litro, con 0.2 g/L de EDTA tetrasódico.

Método

1. Enfríe la solución base. Lleve el HBSS o el PBS sin Ca/Mg a 2-8 °C antes de empezar. La tripsina es una proteasa y se digiere a sí misma; cada minuto que pasa templada y concentrada durante la preparación es actividad que pierde antes incluso de terminar el frasco.
2. Disuelva primero el EDTA. Entra en solución con facilidad y no requiere ningún cuidado especial.
3. Añada el polvo de tripsina lentamente con agitación suave, manteniendo el recipiente frío. No caliente para acelerar la disolución ni agite con tanta fuerza como para formar espuma: las proteínas se desnaturalizan en las interfases aire-líquido.
4. Compruebe el pH. Las soluciones de Trypsin-EDTA se formulan normalmente a pH 7.2-8.0. Ajústelo con hidróxido de sodio o ácido clorhídrico diluidos si es necesario.
5. Complete hasta el volumen final y esterilice por filtración a través de una membrana de 0.22 micras. No lo autoclave nunca: el calor destruye por completo la enzima. Las soluciones de tripsina obstruyen los filtros, así que use un prefiltro y prevea más superficie de membrana de la que el volumen sugiere.
6. Reparta de inmediato en alícuotas de un solo uso y congele una sola vez a entre -30 y -5 °C, protegidas de la luz. Este consejo no es opcional: un frasco que se descongela y vuelve a congelarse repetidamente pierde actividad de forma constante e invisible, y es el motivo principal de que la tripsina preparada en casa tenga fama de poco fiable.

Pesar el polvo exige cuidado. El polvo de tripsina es un sensibilizante respiratorio. Péselo en una vitrina de gases o con extracción localizada y evite generar polvo.

La calidad del agua se arrastra sin filtro alguno. Si va a preparar también la solución base además de la solución enzimática, use agua de grado para cultivo celular con una especificación declarada de bajo contenido en endotoxina.

Una nota sobre lo que está comprando. La designación 1:250 del polvo es una declaración de actividad, no un grado de pureza, y distintos lotes de tripsina porcina bruta varían. Si la reproducibilidad a lo largo de los meses importa más que el coste por litro, la solución ya preparada con una actividad especificada es la mejor opción, y los reactivos recombinantes de tipo tripsina eliminan por completo el problema de la variabilidad entre lotes.

Los volúmenes que siguen corresponden a un frasco T-75 al 80-90% de confluencia. Escale proporcionalmente a la superficie.

1. Atempere los reactivos. Lleve el Trypsin-EDTA, el DPBS sin Ca/Mg y el medio completo a temperatura ambiente o a 37 °C. La actividad de la tripsina a 4 °C es una fracción de la que tiene a 37 °C, y el reactivo frío es, con diferencia, la causa más frecuente de un despegue que "no funciona".
2. Retire por completo el medio agotado. Aspírelo todo. El suero del medio residual contiene inhibidores de proteasas que neutralizarán la tripsina en el momento en que la añada.
3. Lave la monocapa. Añada 5-10 mL de DPBS sin calcio ni magnesio, balancee con suavidad y aspire. Esto elimina tanto el suero residual como el calcio residual. Use un lavado sin Ca/Mg: el DPBS con calcio y magnesio actúa en contra del EDTA. Un lavado suele bastar; dos si el cultivo estaba en medio con mucho suero.
4. Añada el Trypsin-EDTA. De 2 a 3 mL del 0.25%, o de 1 a 2 mL del 0.05%. Balancee el frasco para cubrir toda la superficie y retire después la mayor parte del exceso si trabaja con células sensibles: una película fina es suficiente, y menos reactivo significa menos que neutralizar después.
5. Incube a 37 °C. De 2 a 5 minutos para la mayoría de las líneas. No se aleje. Revise el frasco al microscopio invertido a los 2 minutos: las células deberían estar redondeándose y empezando a despegarse.
6. Libere las células. Cuando la mayoría estén redondeadas, golpee con firmeza el lateral del frasco con la base de la mano. Las células deberían desprenderse en lámina. Si no lo hacen, devuelva el frasco a la estufa 1 minuto y vuelva a comprobarlo, en lugar de prolongar la incubación a ciegas.
7. Neutralice de inmediato. Añada 6-8 mL de medio completo con al menos un 5-10% de suero, o un volumen equivalente con un inhibidor de tripsina definido si trabaja sin suero. Pipetee con suavidad contra la superficie de crecimiento para deshacer los agregados y recoger las células.
8. Centrifugue. De 200 a 300 x g durante 5 minutos. Velocidades mayores dañan las células sin mejorar la recuperación.
9. Resuspenda y cuente. Deseche el sobrenadante, que se lleva consigo la tripsina y el inhibidor, resuspenda el sedimento en medio completo fresco, cuente con azul de tripano y siembre con la proporción de división requerida.

Volúmenes aproximados de Trypsin-EDTA por recipiente

La tripsina no se detiene sola, y las células que quedan en ella siguen siendo digeridas. Hay tres maneras de terminar la reacción y no son intercambiables.

Medio con suero. El suero contiene alfa-1-antitripsina y alfa-2-macroglobulina, que inhiben directamente la tripsina. Añadir dos o tres volúmenes de medio con un 5-10% de suero detiene la reacción prácticamente de inmediato. Esta es la opción por defecto y la razón de que la tripsinización resulte sencilla en cultivos suplementados con suero.

Inhibidor de tripsina definido. En cultivo sin suero, añadir medio sin suero no detiene la tripsina: solo la diluye, y las células seguirán sufriendo daño. El inhibidor de tripsina de soja (SBTI) es la alternativa definida estándar: un único polipéptido que forma con la tripsina un complejo uno a uno estable y enzimáticamente inactivo. Se añade en cantidad aproximadamente equimolar respecto a la tripsina presente. El SBTI inhibe la tripsina, el factor Xa, la plasmina y la calicreína plasmática, pero no tiene efecto sobre las metaloproteasas ni sobre las proteasas de cisteína o aspárticas, algo que conviene saber si su cóctel de disociación contiene además colagenasa o dispasa.

Solo dilución, que basta únicamente con los reactivos diseñados para ello. Los reactivos recombinantes de tipo tripsina como los del tipo TrypLE se inactivan por dilución y no requieren inhibidor, lo que constituye una de las razones de su comodidad en flujos de trabajo sin suero y libres de origen animal. No dé por supuesto este comportamiento en la tripsina porcina convencional.

En todos los casos, elimine el inhibidor mediante centrifugación y resuspensión en medio fresco. Dejar la tripsina y el inhibidor en la suspensión de siembra arrastra proteína y actividad inhibidora de proteasas al siguiente pase, y el SBTI residual en particular puede afectar a experimentos posteriores.

Tripsinización excesiva. El error más frecuente y más dañino. Los síntomas son una viabilidad baja tras el pase, células que se adhieren mal o lentamente en la siembra siguiente, células granulosas o con protrusiones al microscopio, y agregación por el ADN liberado de las células lisadas. De forma menos visible, la tripsina corta las proteínas de superficie: los receptores y marcadores del exterior de la célula son sustratos como cualquier otro. Si un panel de citometría de flujo pierde un marcador tras la tripsinización que sí estaba presente en las mismas células recogidas solo con EDTA, la enzima cortó el epítopo. Para trabajos con marcadores de superficie, use disociación solo con EDTA o un reactivo más suave, o deje que las células se recuperen en medio durante 30-60 minutos antes de teñir.

Tripsinización insuficiente. Quedan zonas de células adheridas. No es un resultado neutro: las células que se despegan primero no son una muestra aleatoria, de modo que una tripsinización insuficiente repetida selecciona en silencio una subpoblación a lo largo de muchos pases. Recoja toda la monocapa o empiece de nuevo.

Arrastre de suero: la razón número uno de que la tripsina "no funcione". Cualquier resto de medio con suero neutraliza la tripsina por contacto. Aspire a fondo y lave. Si el despegue va inesperadamente lento, esto es lo primero que hay que comprobar, antes de aumentar la concentración o el tiempo.

Calcio en el tampón de lavado. Lavar con DPBS que contenga calcio y magnesio justo antes de añadir el Trypsin-EDTA reintroduce exactamente los iones que el EDTA está ahí para retirar. Use la formulación sin Ca/Mg.

Reactivo frío. La tripsina a temperatura de frigorífico actúa con lentitud. Atempérela.

Cultivos con exceso de confluencia. Las células que superan la confluencia depositan una matriz extracelular abundante y cuesta cada vez más levantarlas, lo que tienta a alargar las digestiones y las daña. Haga el pase antes de que la monocapa alcance la confluencia total.

Ciclos repetidos de congelación y descongelación. La tripsina es una proteasa y se digerirá a sí misma. Cada ciclo de congelación-descongelación pierde actividad, y un frasco que se ha descongelado y vuelto a congelar cinco veces se comporta de forma impredecible. Reparta en alícuotas de un solo uso al recibirlo y congele una sola vez.

Reutilizar la tripsina. No lo haga. Más allá del riesgo evidente de contaminación que supone devolver al frasco original un reactivo que ha estado en contacto con células, la actividad de la tripsina usada es desconocida: en parte se ha consumido con el sustrato y en parte está inhibida por el suero que se haya arrastrado.

Arrastre de EDTA a los pasos enzimáticos posteriores. El EDTA quela los cationes divalentes que necesitan las metaloproteasas. Llevar células tratadas con Trypsin-EDTA directamente a una digestión con colagenasa o dispasa inhibirá esas enzimas, a veces por completo. Lave con un tampón que contenga cationes divalentes entre pasos.

La tripsina pancreática porcina es un reactivo de origen animal, lo que importa por tres razones: las expectativas regulatorias en terapia celular y biofabricación, la variabilidad entre lotes inherente a un extracto tisular bruto y el riesgo teórico de agentes adventicios. Varias alternativas abordan esta cuestión.

Proteasas recombinantes de tipo tripsina. Producidas por fermentación microbiana en lugar de extraídas del páncreas, aportan una única enzima definida en vez de una mezcla de proteasas. Su cinética de disociación es comparable a la de la tripsina porcina con menor citotoxicidad, son estables a temperatura ambiente y en refrigeración en lugar de requerir congelación, y la simple dilución las inactiva, lo que elimina la necesidad de suero o de un inhibidor. Son el sustituto más directo de la tripsina convencional en un flujo de trabajo sin suero.

Disociación solo con EDTA (Versene). Una solución quelante sencilla, normalmente 0.5 mM de EDTA en PBS sin Ca/Mg, sin enzima alguna. Como no se corta nada, las proteínas de superficie se conservan intactas: es el reactivo de elección cuando la citometría de flujo posterior depende de epítopos de superficie. También es el método estándar para el pase en agregados de células madre pluripotentes humanas, donde la disociación enzimática hasta células individuales causa problemas. Los inconvenientes son que es más lento, que no levantará en absoluto las células firmemente adheridas y que las células se desprenden en láminas y agregados en lugar de como una suspensión de células individuales.

Medios de disociación químicamente definidos y sin enzimas. Alternativas formuladas que combinan la quelación con otros mecanismos no enzimáticos, ofreciendo más constancia que el EDTA solo y manteniendo intactas las proteínas de superficie.

Reactivos de tipo Accutase. Actividad proteolítica y colagenolítica mixta de origen no mamífero. Más suaves que la tripsina bruta con muchos tipos celulares y ampliamente usados para células madre y neuronas, aunque algunas comparaciones directas han descrito mejor viabilidad con reactivos recombinantes de tipo tripsina que con Accutase en determinados sistemas.

Elegir entre ellos depende de lo que necesite conservar. Si son los epítopos de superficie, use EDTA o un reactivo sin enzimas. Si es el cumplimiento regulatorio y la reproducibilidad, use una enzima recombinante. Si es la rapidez con un cultivo primario obstinado, la tripsina bruta al 0.25% con EDTA sigue llevando ventaja: es agresiva precisamente porque es una mezcla de proteasas, y a veces eso es lo que el tejido requiere.

El Trypsin-EDTA líquido se conserva normalmente congelado, típicamente a entre -30 y -5 °C protegido de la luz, con una caducidad de unos 24 meses. Una vez descongelado, un frasco de trabajo mantenido a 2-8 °C conserva una actividad utilizable durante unas semanas, aunque la actividad decae de forma constante por autólisis; anote la fecha de descongelación.

Reparta en alícuotas al recibirlo. Descongele el frasco una vez, divídalo en volúmenes de un solo uso adaptados a su forma real de trabajar y vuelva a congelarlos. Este es el hábito de mayor valor en la manipulación de la tripsina, porque elimina la pérdida de actividad por congelación-descongelación que hace que los resultados vayan a la deriva con los meses.

Los reactivos recombinantes de tipo tripsina son en general estables a 2-8 °C y a menudo a temperatura ambiente, lo que suprime por completo el problema de la congelación-descongelación y constituye una de sus ventajas prácticas.

Esterilidad. El Trypsin-EDTA se esteriliza por filtración y no contiene conservante. Entra en contacto directo con las células y es una vía frecuente de contaminación hacia un cultivo por lo demás limpio. Decante en lugar de pipetear del frasco original, no devuelva el reactivo sobrante y deseche cualquier frasco de aspecto turbio.

pH y rojo de fenol. Las soluciones de Trypsin-EDTA se formulan típicamente a pH 7.2-8.0. En las formulaciones con rojo de fenol, un frasco que se ha vuelto amarillo ha bajado de pH, lo que normalmente significa que se ha contaminado o que ha estado templado demasiado tiempo: deséchelo.

Protección personal. El polvo de tripsina es un sensibilizante respiratorio y debe pesarse con extracción; las soluciones ya preparadas son de bajo riesgo. Se aplican las prácticas habituales para cualquier material de origen animal utilizado en el laboratorio.