Medio químicamente definido

Un medio es químicamente definido cuando se conocen la identidad química y la concentración de cada uno de sus componentes.

Ese criterio excluye, por definición:

• El suero (fetal bovino, de ternera recién nacida, humano), que contiene miles de proteínas, lípidos, hormonas y metabolitos en concentraciones que varían entre lotes y entre animales donantes
• Los hidrolizados de proteínas y las peptonas — de soja, trigo, levadura, caseína —, que son digestos enzimáticos formados por mezclas indefinidas de péptidos de secuencia desconocida
• Los extractos tisulares y vegetales, el medio condicionado, el lisado plaquetario y cualquier otra preparación biológica de composición no caracterizada

Lo que no excluye es la proteína. Un medio químicamente definido puede contener insulina humana recombinante, transferrina recombinante, albúmina recombinante o un factor de crecimiento recombinante, porque cada uno de ellos es una única molécula de secuencia conocida añadida a una concentración conocida. Este es el punto que más se malinterpreta, y explica por qué «químicamente definido» y «sin proteínas» son dos etiquetas diferentes que simplemente se solapan.

Conviene fijarse también en lo que la definición no promete. Que un medio sea químicamente definido no dice nada sobre si está libre de origen animal: la insulina bovina purificada de páncreas es una molécula definida, pero de origen animal. Y tampoco dice nada sobre el rendimiento. Un medio químicamente definido es un medio cuya composición se conoce, lo cual es un requisito previo para el control y la reproducibilidad, no una garantía de mayor productividad.

Estos cuatro términos se usan de forma laxa en los catálogos y de forma rigurosa en los expedientes regulatorios. No forman una única escala, y entender cómo se cruzan evita errores de compra costosos.

Con suero. El enfoque clásico: un medio basal como DMEM o RPMI 1640 más un 5–20% de suero fetal bovino. El suero aporta todo lo que el medio basal omite: lípidos y colesterol, transferrina y hierro, albúmina como transportador y detoxificante, factores de crecimiento, hormonas, factores de adhesión e inhibidores de proteasas. Es cómodo y universalmente permisivo, y es también la mayor fuente individual de variabilidad en el cultivo celular.

Sin suero (SFM). No lleva suero. Las funciones del suero se sustituyen por adiciones específicas, que pueden incluir proteínas purificadas o recombinantes, hidrolizados, suplementos lipídicos y mezclas hormonales definidas como ITS (insulina, transferrina, selenio) o sus variantes. Sin suero no significa definido: un medio sin suero que contiene hidrolizado de soja es indefinido.

Libre de origen animal (AOF) / libre de componentes animales (ACF) / libre de componentes derivados de animales (ADCF). Ningún componente de origen animal en ninguna parte de la formulación ni de su fabricación, incluidas las materias primas de las materias primas. Se admiten hidrolizados vegetales y proteínas recombinantes expresadas en hospedadores no animales. Se trata de una afirmación sobre el origen, relativa a la bioseguridad y al riesgo de agentes adventicios, no de una afirmación sobre la composición: un medio AOF con hidrolizado de soja está libre de origen animal, pero no es definido. Xeno-free es el término afín que se emplea en terapia celular humana y significa libre de componentes animales no humanos; un medio xeno-free puede contener materiales de origen humano, como albúmina sérica humana o lisado plaquetario humano.

Sin proteínas. Ninguna proteína de ningún tipo, tampoco recombinante. Todavía pueden estar presentes péptidos e hidrolizados, de modo que «sin proteínas» tampoco equivale automáticamente a definido.

Químicamente definido (CD). Todos los componentes conocidos por identidad y concentración. Por construcción, siempre sin suero y sin hidrolizados. Puede contener proteínas recombinantes. Químicamente definido sin proteínas (PFCD) es la categoría habitual más estricta: definido y sin ninguna proteína, con las funciones cubiertas por moléculas pequeñas, péptidos sintéticos, emulsiones lipídicas e iones metálicos quelados.

Merece la pena enunciar las relaciones de forma explícita, porque son el origen de la mayor parte de la confusión: todo medio químicamente definido es un medio sin suero, pero la mayoría de los medios sin suero no son químicamente definidos. Un medio sin proteínas no es necesariamente químicamente definido. Un medio libre de origen animal no es necesariamente químicamente definido. Y un medio químicamente definido no está necesariamente libre de origen animal.

Dado que un medio químicamente definido se define en buena medida por lo que elimina, conviene precisar qué es el suero.

El suero es la fracción líquida de la sangre coagulada, una vez retirados las células y los factores de coagulación. El suero fetal bovino (FBS), el más utilizado, se obtiene de terneros fetales en el sacrificio de vacas gestantes; también se emplean suero de ternera recién nacida, suero bovino adulto, suero de caballo y suero humano. Es un fluido biológico, no una formulación, y nadie dispone de un inventario completo de su contenido.

Lo que aporta a un cultivo:

• Albúmina, a unos 20–40 g/L en el suero sin diluir, que actúa como transportador de ácidos grasos, hormonas y metales traza, como amortiguador frente al cizallamiento y como sumidero de especies tóxicas
• Transferrina, que aporta hierro en una forma que las células pueden captar
• Factores de crecimiento y hormonas —insulina, IGF-1 e IGF-2, EGF, PDGF, FGF, hidrocortisona, hormonas tiroideas— a concentraciones que varían entre lotes y entre animales donantes
• Lípidos —colesterol, fosfolípidos, ácidos grasos libres—, que la mayoría de las células en cultivo no pueden sintetizar en cantidad suficiente
• Factores de adhesión, entre ellos la fibronectina y la vitronectina
• Inhibidores de proteasas, razón por la cual el medio con suero neutraliza la tripsina
• Elementos traza, vitaminas y metabolitos en niveles no caracterizados

Al 10% en un cultivo, el suero aporta varios gramos de proteína por litro. Por eso funciona tan bien y por eso es un problema tan grande: es un suplemento permisivo y de amplio espectro cuya composición ni se conoce ni se controla. Dos lotes del mismo proveedor pueden diferir de forma medible en su actividad promotora del crecimiento, y por eso los laboratorios ensayan lotes y luego compran existencias para años del lote que funciona.

El suero conlleva además riesgo de agentes adventicios —virus, micoplasmas y, históricamente, preocupación por las encefalopatías espongiformes transmisibles—, que es lo que impulsa la presión regulatoria hacia procesos definidos y libres de origen animal para todo aquello destinado a uso humano.

Construir un medio definido consiste en reemplazar, una por una, cada función que desempeñaba el suero. En la práctica, para eso sirven las adiciones.

Aporte de hierro. Las células necesitan hierro y no captan de forma eficiente el ion férrico libre; el suero aporta transferrina. Los medios definidos utilizan transferrina humana recombinante o, en las formulaciones sin proteínas, un quelante sintético como citrato férrico amónico, citrato férrico o un quelato de hierro con hidroxipiridinona.

Señalización por insulina. Insulina humana recombinante a aproximadamente 5–10 mg/L, o el análogo más estable LONG-R3 IGF-1 en los medios de bioproducción. Suele ser el factor individual que más impulsa el crecimiento en una formulación definida.

Selenio. Selenito de sodio en niveles de nanomolares bajos a micromolares, necesario como cofactor de la glutatión peroxidasa y la tiorredoxina reductasa. Sin él, las células en un medio sin suero acumulan daño oxidativo.

Lípidos. El suero aporta colesterol, ácidos grasos y fosfolípidos. Los medios definidos emplean un concentrado lipídico químicamente definido: por lo general colesterol y los ácidos araquidónico, linoleico, linolénico, mirístico, oleico, palmítico y esteárico, solubilizados con un tensioactivo sintético como Pluronic F-68 y, cuando está permitido, un transportador de tipo ciclodextrina. Las líneas CHO y NS0 en suspensión dependen especialmente del colesterol.

Capacidad antioxidante y de transporte. En el suero, la albúmina cumple en parte la función de unir y detoxificar ácidos grasos libres y especies reactivas. La albúmina recombinante cubre este papel en los medios definidos que admiten proteínas; las formulaciones sin proteínas recurren en su lugar a antioxidantes de bajo peso molecular, a un aporte adicional de selenio y a un control cuidadoso de los metales traza.

Elementos traza. Cobre, cinc, manganeso, molibdeno, vanadio, níquel y otros, en niveles nanomolares. El suero los aporta de forma invisible; un medio definido debe especificarlos, y equivocarse en el paquete de elementos traza es una causa frecuente de que una formulación definida rinda por debajo de lo esperado.

Protección frente al cizallamiento. Pluronic F-68 a 0.1–1 g/L en cultivo en suspensión y en biorreactor, para proteger a las células del daño por burbujeo y agitación en ausencia de proteína sérica.

Factores de adhesión. Para células adherentes, fibronectina, vitronectina o laminina recombinantes, o un recubrimiento sintético definido de la superficie.

El medio basal que hay debajo de todo esto no suele ser uno clásico. La mayoría de las formulaciones definidas parten de una base propietaria rica en nutrientes y de osmolalidad elevada —a menudo derivada de DMEM/F-12—, porque medios clásicos como DMEM y RPMI se diseñaron dando por hecho que el suero cubriría sus carencias.

Reproducibilidad. La variabilidad entre lotes de suero es la mayor variable no controlada en la mayoría de los cultivos celulares. Dos lotes de FBS pueden diferir de forma sustancial en actividad promotora del crecimiento, contenido hormonal y perfil lipídico, y por eso los laboratorios ensayan lotes y luego compran existencias para años. Un medio definido elimina por completo esta variable: la misma formulación se comporta igual en 2026 que en 2020.

Posición regulatoria y de bioseguridad. El suero conlleva riesgo de agentes adventicios: virus, micoplasmas y, históricamente, preocupación por las encefalopatías espongiformes transmisibles. Los reguladores esperan medidas de mitigación del riesgo y documentación de las materias primas de origen animal en cualquier producto destinado a uso humano. Un proceso químicamente definido y libre de origen animal elimina un capítulo entero de esa carga. En terapia celular y génica, en particular, los medios definidos y xeno-free son en la práctica una exigencia y no una opción.

Purificación posterior. El suero aporta gramos de proteína por litro que deben separarse del producto recombinante. Un medio definido —sobre todo si está libre de proteínas— simplifica enormemente la captura y el pulido, y mejora la pureza del producto.

Interpretabilidad experimental. En estudios de señalización, metabolismo, endocrinología y respuesta a fármacos, el suero introduce hormonas, factores de crecimiento, proteínas de unión y lípidos que confunden la medida. La albúmina sérica se une a compuestos hidrófobos y desplaza las concentraciones efectivas de fármaco. Los medios definidos hacen que los datos de dosis-respuesta signifiquen lo que uno cree que significan.

Suministro y coste a escala. El suministro de suero es finito, su precio es volátil y su uso está cuestionado desde el punto de vista ético. A escala de producción, un medio definido es a la vez más predecible y, en volumen, normalmente más barato.

Dónde sigue teniendo sentido el suero: en el cultivo exploratorio de células primarias, en protocolos consolidados para los que no se ha validado una alternativa definida y en cualquier situación en la que el coste de la adaptación supere el valor de eliminar la variable. Los medios definidos no son mejores de forma universal; son mejores cuando el control importa.

El cultivo de células madre pluripotentes es el ámbito en el que los medios químicamente definidos se volvieron inevitables, porque las capas alimentadoras y los sustitutos del suero, al no estar definidos, hacían imposible reproducir los experimentos de diferenciación. Es también el ejemplo publicado más claro del aspecto que tiene realmente una formulación definida.

La formulación Essential 8 (E8), publicada por Chen y sus colaboradores en el laboratorio de Thomson en 2011, permite derivar y cultivar iPSC humanas con ocho componentes, una demostración deliberada de que gran parte de lo que contenían los medios anteriores para células madre era innecesario. Las concentraciones que siguen son las de la publicación original:

Merece la pena señalar tres cosas. El medio basal es DMEM/F-12, y no DMEM ni RPMI, porque los elementos traza y los precursores lipídicos del F-12 hacen falta una vez que se retira el suero. El ascorbato se aporta como sal 2-fosfato, no como ácido ascórbico libre, porque el ascorbato libre se oxida en solución en cuestión de días. Y la formulación contiene proteínas recombinantes —insulina, transferrina, FGF2, TGF-β1—, que es exactamente la razón por la que es químicamente definida y no libre de proteínas.

Los medios para células estromales mesenquimales siguen una lógica similar sobre una base distinta, normalmente α-MEM o DMEM/F-12 con insulina, transferrina, selenio, FGF2 y PDGF, en sustitución del 10–20% de FBS de los protocolos clásicos para MSC. Para el trabajo de grado clínico suelen especificarse además como xeno-free, no solo como definidos.

Cuando ningún producto de catálogo encaja, los medios se formulan por encargo. Esto es más frecuente de lo que parece —una parte importante de la bioproducción funciona con formulaciones a medida— y conviene entender qué implica el proceso antes de solicitar una.

Cuándo se justifica una formulación a medida:

• Un medio existente funciona bien pero necesita uno o dos cambios: otro nivel de glucosa, retirar la glutamina, retirar el rojo de fenol, cambiar el tampón u omitir un componente para un estudio con trazadores metabólicos
• Un proceso se ha optimizado a escala de laboratorio con una base más varios suplementos, y consolidarlos en una única formulación eliminaría pasos de manipulación y variabilidad
• Se necesita una formulación publicada que ningún proveedor tiene en catálogo
• El escalado exige un formato en polvo o concentrado de algo que ahora se compra líquido
• Los requisitos regulatorios obligan a disponer de una versión libre de origen animal o totalmente definida de un medio que actualmente contiene hidrolizados

Qué suele implicar el proceso. Se acuerda una especificación que recoge la lista de componentes con sus concentraciones, los objetivos de pH y osmolalidad, el formato (líquido, polvo o concentrado), el volumen de llenado y los requisitos de esterilidad, endotoxinas y ensayos de rendimiento. Se fabrica un lote piloto y se contrasta con la especificación objetivo y, sobre todo, con sus células: una formulación que cumple su especificación química puede aun así rendir por debajo de lo esperado. Una vez aceptado el piloto, la formulación se bloquea y los lotes posteriores se fabrican conforme a ella, con un certificado de análisis por lote.

Qué hay que especificar y a menudo se olvida. Si la glutamina se incluye o se suministra por separado. Si el bicarbonato de sodio va en el polvo o se añade en la reconstitución, y a qué atmósfera de CO2 apunta la formulación. El objetivo de osmolalidad, no solo la lista de componentes: pequeños cambios en las sales o en la glucosa lo desplazan. La decisión sobre el rojo de fenol. Si se exige la condición de libre de origen animal, que condiciona el origen de las materias primas aguas arriba del propio medio. Y el formato de conservación, ya que el polvo y el líquido tienen caducidades y costes de transporte muy distintos.

Para la mayoría de los laboratorios, la secuencia sensata es partir de la formulación de catálogo más próxima, demostrar la modificación a escala de laboratorio con suplementos y solo entonces consolidarla en un lote a medida, en lugar de encargar una formulación específica partiendo de la teoría.

La selección depende de la línea celular. No existe un medio químicamente definido de uso general. Los medios CD se desarrollan y optimizan frente a un hospedador concreto —CHO, HEK293, BHK-21, NS0, hibridoma, Vero, iPSC— y una formulación que funciona bien con CHO con frecuencia no sostiene en absoluto a HEK293. Parta de su célula hospedadora y después de su aplicación: expansión, transfección transitoria, producción estable, producción de virus o diferenciación favorecen formulaciones distintas.

La adaptación es un proceso, no un cambio inmediato. Las células mantenidas en suero durante muchos pases han reprimido rutas que no necesitaban. Hay dos enfoques estándar:

Adaptación secuencial. Reducir el suero por etapas —10%, 5%, 2.5%, 1%, 0.5%, 0%—, manteniendo cada nivel durante dos o tres pases hasta que la velocidad de crecimiento y la viabilidad se recuperen antes de la siguiente reducción. Es más lenta, pero tiene mayor tasa de éxito y menor deriva genética.

Adaptación directa. Sembrar a alta densidad directamente en el medio definido y ir haciendo pases a lo largo de la recuperación. Es más rápida cuando funciona, y funciona más a menudo con líneas robustas en suspensión que con células adherentes o primarias.

En ambos casos conviene sembrar a una densidad mayor de la habitual —las células en un medio definido son mucho más sensibles a los factores de acondicionamiento que ellas mismas secretan— y hay que contar con que el cultivo tenga mal aspecto durante varios pases antes de recuperarse. Mantenga una reserva congelada de las células crecidas en suero en cada etapa. La adaptación suele llevar de cuatro a ocho semanas.

Valide después, y no solo la velocidad de crecimiento. Las células adaptadas pueden diferir de la línea parental en tiempo de duplicación, perfil metabólico, glicosilación de la proteína secretada, expresión de marcadores de superficie y eficiencia de transfección. Vuelva a establecer la línea base de los ensayos que le importan y cree un nuevo banco celular maestro en el medio definido.

Notas prácticas. Los medios definidos se suministran a menudo sin L-glutamine, para poder añadirla recién preparada o sustituirla por el dipéptido estable L-alanil-L-glutamina. Muchos se suministran en polvo para su reconstitución a gran escala. Como no hay proteína sérica que amortigüe las desviaciones de pH, osmolalidad y cizallamiento, los cultivos en medio definido toleran peor los errores de proceso: controle las alimentaciones, el CO2 y la agitación con más rigor de lo que haría con suero.

«Químicamente definido significa sin proteínas». No es así. Un medio CD puede contener insulina, transferrina o albúmina recombinantes. Químicamente definido sin proteínas (PFCD) es la categoría aparte y más estricta.

«Sin suero significa definido». No es así. La mayoría de los medios sin suero contienen hidrolizados vegetales o de levadura, que son mezclas indefinidas de péptidos.

«Libre de origen animal significa definido». No es así. El hidrolizado de soja está libre de origen animal y es completamente indefinido.

«Químicamente definido significa libre de origen animal». No necesariamente. La insulina bovina o el colesterol de origen animal son moléculas definidas de procedencia animal. Si necesita ambas propiedades, busque un medio etiquetado como químicamente definido y libre de origen animal o ADCF.

«Un medio definido hará crecer cualquier cosa». Los medios definidos son específicos del hospedador y, en general, menos permisivos que los medios con suero. Ese es el coste directo de eliminar el soporte amplio e indefinido del suero.

«La adaptación es trabajo de una semana». Lo habitual son de cuatro a ocho semanas, y la línea adaptada debe tratarse como una línea nueva que requiere una nueva caracterización.