Contaminación en el cultivo celular

Conviene separar la contaminación del cultivo celular en dos grupos, porque exigen comportamientos de laboratorio completamente distintos.

El grupo visible —bacterias, levaduras y hongos filamentosos— crece rápido, altera el medio y resulta evidente en un plazo de uno a cinco días. Estos se detectan mirando. Son molestos, pero se delatan solos, y la pregunta útil no es «qué es», sino «cómo entró», porque la respuesta es casi siempre un fallo concreto y corregible de la técnica aséptica.

El grupo invisible —micoplasma, contaminación viral y contaminación cruzada con una línea celular mal identificada— no produce turbidez, ni cambio de color, ni nada que se pueda ver. Solo se detecta mediante ensayos deliberados, y resulta mucho más dañino para los resultados precisamente porque es silencioso. Una línea mal identificada o positiva para micoplasma seguirá generando datos de aspecto impecable y reproducibles, pero sobre el objeto equivocado.

Existe una séptima categoría que merece nombrarse: la contaminación química —endotoxina, residuos de detergente, plastificantes lixiviados de las tubuladuras, iones metálicos o un componente del medio fuera de especificación—. No es un organismo, es invisible y produce exactamente los síntomas que con más frecuencia se atribuyen a que «las células están descontentas»: crecimiento lento, adherencia deficiente e incapacidad para alcanzar la confluencia.

Aspecto. El medio se vuelve turbio o lechoso, por lo general entre 24 y 72 horas después del episodio que la introdujo. Con rojo de fenol en el medio, una población aerobia o facultativa abundante baja el pH y vira el medio de rojo anaranjado a amarillo. Bajo contraste de fases a 200–400×, las bacterias aparecen como bacilos, cocos o cocobacilos muy pequeños, típicamente de 0,5–1 µm de ancho y hasta unos 20 µm de largo, que se desplazan entre las células con un evidente movimiento browniano o, en especies móviles, dirigido. Un fondo granular y centelleante entre las células adheridas que ayer no estaba ahí es el primer signo clásico.

Orígenes frecuentes. La técnica del operador: manos, mangas, hablar sobre recipientes abiertos, pasar un objeto no estéril por encima de un frasco abierto. Baños termostáticos y bandejas de agua del incubador contaminados. Suplementos sin filtrar o filtrados de forma incorrecta. Un frasco de reserva contaminado utilizado en varias líneas.

Respuesta. Descartar. Autoclavar o desinfectar el recipiente antes de sacarlo de la cabina. No intente rescatar con antibióticos un frasco con contaminación bacteriana: aunque se suprima el crecimiento visible, persisten supervivientes en bajo nivel y su carga de endotoxina, y habrá convertido un problema evidente en uno oculto.

Aspecto. Al microscopio, las levaduras aparecen como partículas discretas ovoides o esféricas, típicamente de 3–5 µm y, por tanto, claramente mayores que las bacterias, a menudo con gemación visible: una célula hija más pequeña unida a una madre mayor. La gemación es el rasgo identificativo más útil.

El medio se enturbia, pero normalmente más despacio que con las bacterias y a menudo solo cuando la contaminación ya está bien establecida. El comportamiento del pH es característico y conviene conocerlo: las levaduras producen poco cambio de pH hasta que la contaminación es intensa, momento en el que el pH suele subir en lugar de bajar. Un cultivo que se ha enturbiado mientras el rojo de fenol ha virado a rosa violáceo en vez de a amarillo corresponde con más probabilidad a levaduras que a bacterias.

Orígenes frecuentes. Vía aérea: las levaduras abundan en el ambiente general, de modo que una cabina con el flujo de aire comprometido, un filtro HEPA mal mantenido o el trabajo realizado fuera de la cabina son la explicación habitual. Piel y cabello. Baños termostáticos contaminados.

Respuesta. Descartar. Después, revise la cabina: certifique el flujo de aire, compruebe el filtro y verifique que nadie trabaja con la ventana a una altura incorrecta.

Aspecto. Los hongos filamentosos son, de todos los contaminantes, los más evidentes a la vista. Al microscopio, los micelios aparecen como filamentos ramificados finos y sinuosos (hifas) que atraviesan el campo, a veces con acúmulos más densos de esporas. A simple vista, la contaminación comienza como pequeños puntos algodonosos blancos, amarillos, grises o negros, flotando en el medio o adheridos a la pared del frasco a la altura de la superficie del líquido, y en pocos días se convierte en grandes placas vellosas. El medio suele permanecer claro más tiempo que con las bacterias, y el pH puede subir ligeramente a medida que avanza el cultivo.

El aspecto «filamentoso» o «de algodón» que se describe en un frasco corresponde casi siempre a un hongo filamentoso.

Orígenes frecuentes. Esporas transportadas por el aire: las esporas fúngicas son resistentes, ubicuas y sobreviven mucho tiempo sobre las superficies. Obras en el edificio, humedad, incubadores mal mantenidos (la bandeja de agua es un reservorio clásico) y estantes del incubador contaminados. El cartón del embalaje introducido en la sala de cultivo es una fuente infravalorada.

Respuesta. Descartar y tratarlo como un incidente a escala de incubador, no de frasco. Vacíe el incubador, retire y autoclave los estantes y la bandeja de agua, ejecute el ciclo de descontaminación del equipo o limpie las superficies con un agente esporicida aprobado, y reponga el contenido de la bandeja con agua estéril nueva que incluya un tratamiento antifúngico para agua aprobado. Las esporas fúngicas que han colonizado un incubador seguirán reinfectando los cultivos nuevos hasta que se limpie el propio incubador.

Aspecto. Ninguno. Ahí reside todo el problema. El micoplasma alcanza 10⁷–10⁸ organismos por mL sin turbidez, sin cambio visible de pH y sin nada detectable en un microscopio invertido de rutina. Con un tamaño de 0,3–0,8 µm y sin pared celular, atraviesa los filtros de 0,2 µm y es intrínsecamente resistente a la penicilina.

Los signos indirectos son inespecíficos y fáciles de justificar de otro modo: enlentecimiento gradual del crecimiento, menor densidad de saturación, agotamiento del medio más rápido de lo previsto, caída de la eficiencia de transfección, deriva en la respuesta a fármacos. Cualquiera de ellos debería motivar un ensayo, y no un cambio de lote de suero.

Orígenes frecuentes. Otros cultivos contaminados en el mismo laboratorio, propagados por aerosoles y frascos compartidos; el personal del laboratorio, ya que varias de las especies contaminantes son comensales de la cavidad oral humana; el suero y la tripsina de origen animal, históricamente importantes y hoy mucho menos relevantes; y las líneas celulares recibidas de fuentes ajenas a un banco reconocido.

Respuesta. Confirmar por un segundo método, poner en cuarentena y, por lo general, descartar: reiniciar a partir de un vial congelado limpio es más rápido y más defendible que el tratamiento. La comparación completa de los métodos de detección, la frecuencia de los ensayos y la decisión entre eliminación y descarte se tratan en la referencia sobre pruebas de micoplasma.

Aspecto. Normalmente ninguno en el cultivo productor. Muchos virus se replican en una línea celular huésped sin efecto citopático, de modo que el cultivo se ve y crece con normalidad. Cuando sí aparece efecto citopático, se manifiesta como redondeamiento, desprendimiento, formación de sincitios o zonas claras de tipo placa en la monocapa, fáciles de confundir con un exceso de confluencia o una tripsinización defectuosa.

Por qué importa. La contaminación viral rara vez es un problema en cultivos de investigación de rutina, pero sí lo es, y grave, en cualquier material destinado a la fabricación de biológicos o terapias celulares, y constituye una consideración de bioseguridad cuando el material de partida es humano o de primate.

Orígenes frecuentes. El tejido original o el material del donante; las materias primas de origen animal, principalmente suero y tripsina; y otros cultivos de la instalación.

Respuesta. Los ensayos virales son trabajo especializado: paneles de PCR para agentes concretos y ensayos in vitro de agentes adventicios sobre líneas celulares indicadoras para un cribado amplio. En investigación de rutina, la prevención es el control práctico: utilice suero y tripsina de proveedores que publiquen datos de cribado viral, o bien reactivos libres de origen animal (ADCF) y enzimas de disociación recombinantes, que eliminan por completo esta vía.

La contaminación de mayor trascendencia en biología celular no es un organismo: es una línea celular que invade a otra, o que ha sido mal etiquetada en algún momento de su historia.

Los estudios de autenticación a gran escala han demostrado repetidamente que una minoría significativa de las líneas celulares en uso activo en los laboratorios no son lo que indica su etiqueta. HeLa es la responsable más conocida —de crecimiento rápido, robusta e históricamente causante del desplazamiento de muchas otras líneas—, pero cualquier línea vigorosa invadirá a otra más lenta si llegan a mezclarse.

Aspecto. Ninguno, o una deriva lenta en la morfología, la velocidad de crecimiento o la expresión de marcadores, fácil de atribuir al número de pase.

Orígenes. Manipular dos líneas en la cabina al mismo tiempo. Frascos de medio compartidos. Viales mal etiquetados. Registros deficientes del congelador. Recibir una línea de un colaborador cuya propia cadena de custodia se desconoce.

Respuesta y prevención. El perfil de repeticiones cortas en tándem (STR) es el método de autenticación estándar para líneas humanas, y existen paneles de STR de ratón para las líneas murinas. Determine el perfil de una línea cuando la reciba, cuando la banquee y de forma periódica a partir de entonces. Nunca tenga dos líneas celulares abiertas a la vez en la cabina. Nunca comparta un frasco de medio entre líneas. La mayoría de las revistas exigen ya una declaración de identidad verificada por STR, y el coste de un perfil es insignificante frente al de repetir un experimento.

No todo lo que parece anómalo está vivo. Antes de descartar un cultivo, descarte las explicaciones no biológicas:

• La endotoxina procedente del agua, el suero o las materias primas activa las células inmunocompetentes y altera el crecimiento y la diferenciación sin ningún signo visible. Es termoestable, sobrevive al autoclavado y no se elimina por filtración a 0,2 µm.
• Residuos de detergente o desinfectante en el material de vidrio o procedentes de una superficie de la cabina mal aclarada.
• Lixiviación de plastificantes o extraíbles de tubuladuras, frascos de almacenamiento o plásticos no aptos para cultivo celular.
• Los precipitados —cristales de fosfato de calcio, proteína sérica precipitada o componentes del medio cristalizados tras el almacenamiento en frío— parecen contaminación particulada al microscopio, pero son refringentes, geométricos, no se mueven por sí solos y no se multiplican entre observaciones. Vuelva a examinar al cabo de cuatro horas: la contaminación crece, el precipitado no.
• Los restos celulares y los cuerpos apoptóticos de un cultivo estresado o con exceso de confluencia pueden asemejarse a una contaminación bacteriana a bajo aumento. Subir el aumento suele resolver la duda.

Ordenado aproximadamente según la cantidad de contaminación que evita cada medida por unidad de esfuerzo:

1. Técnica aséptica y disciplina en la cabina. Trabaje con la ventana a la altura correcta, mantenga las manos y el material aguas abajo de las aberturas críticas, no pase nunca nada por encima de un recipiente abierto, limpie con etanol al 70% cada objeto que entre en la cabina y no hable dentro de ella. Este único punto evita la mayor parte de la contaminación.
2. Una sola línea abierta cada vez, un frasco por línea. Elimina de un golpe la contaminación cruzada y la mayor parte de la diseminación microbiana horizontal.
3. Ponga en cuarentena los cultivos entrantes en un incubador aparte hasta que se hayan analizado.
4. Mantenga el incubador. Cambio semanal de la bandeja de agua con un tratamiento aprobado, limpieza mensual de superficies, ciclo de descontaminación programado y cambio del filtro HEPA en el intervalo indicado por el fabricante.
5. Certifique la cabina anualmente y compruebe que la alarma de flujo de aire funciona.
6. Banquee pronto, banquee limpio y analice el banco. Un banco maestro analizado y de pase bajo convierte un episodio de contaminación en una molestia de una tarde.
7. No utilice antibióticos profilácticos como sustituto de nada de lo anterior. Ocultan la contaminación bacteriana de bajo nivel, no hacen nada frente al micoplasma, los hongos o la contaminación cruzada, y llevan a los laboratorios a dejar de percibir que su técnica se ha degradado.