Dispasa

La dispasa es una proteasa neutra aislada de filtrados de cultivo de Paenibacillus polymyxa (descrita en la literatura antigua como Bacillus polymyxa). Está catalogada como EC 3.4.24.4, CAS 9001-92-7, con una masa molecular de aproximadamente 35900 Da. La denominación «dispasa II» se refiere al grado que se suministra habitualmente, no a una enzima distinta.

Desde el punto de vista estructural es una metaloproteasa que une un ion de zinc y cuatro iones de calcio por subunidad. El zinc es catalítico: si se retira con un quelante, queda una apoenzima inactiva. El calcio es estructural, mantiene el plegamiento y protege a la enzima frente a la autólisis. Ambos hechos tienen consecuencias prácticas directas, que se detallan más abajo, y son la principal diferencia de manejo respecto a la tripsina.

Su perfil de sustratos es la razón de que exista como producto propio y no como una proteasa general más. Stenn y colaboradores la caracterizaron en 1989 y demostraron que la dispasa corta la fibronectina y el colágeno de tipo IV, pero no la laminina, el colágeno de tipo V, la albúmina sérica ni la transferrina. El colágeno de tipo I se degrada solo mínimamente, y la acción sobre el colágeno de tipo IV genera varios productos de degradación estables en lugar de una digestión completa.

El colágeno de tipo IV y la fibronectina son componentes de la membrana basal. La laminina, que la dispasa deja intacta, es otro. En la práctica esto significa que la dispasa ataca la capa situada entre un epitelio y el tejido conjuntivo subyacente y deja en gran medida intactas las uniones de las células epiteliales entre sí. Es una capacidad muy concreta y muy útil: separa el tejido a la altura de la membrana basal y levanta láminas en lugar de disolverlas en células individuales.

Al ser de origen bacteriano, la dispasa es libre de origen animal, algo relevante en flujos de trabajo regulados en los que la tripsina porcina supone un problema.

La actividad de la dispasa se define mediante un ensayo de digestión de caseína: una unidad es la cantidad de enzima que libera aminoácidos positivos a Folin equivalentes a 1 micromol de tirosina por minuto a 37 °C y pH 7.5, con caseína como sustrato.

La actividad específica de la dispasa comercial varía mucho según el grado y el lote. Una preparación parcialmente purificada puede especificarse en torno a 1.2 unidades/mg, mientras que un producto de grado superior se especifica en 4 unidades/mg o más: una diferencia de tres veces o más en actividad enzimática para la misma masa de polvo.

Este es el punto práctico más importante de la dispasa y donde con más frecuencia fallan los protocolos al trasladarse de un laboratorio a otro. Un protocolo escrito como «dispasa 1 mg/mL» no es reproducible si no indica además la actividad específica del lote empleado. El 1 mg/mL de un laboratorio equivale, en términos enzimáticos, a 3 mg/mL en otro. Cuando un método publicado da la concentración en unidades por mililitro, utilice unidades; cuando la da en miligramos, consulte el certificado de análisis del lote y haga la conversión.

La literatura publicada refleja ambas convenciones. Los métodos de separación de la piel suelen escribirse en unidades —se han empleado 500 a 1000 U/mL en DMEM para despegar láminas epidérmicas de piel humana tras 24 horas—, mientras que los protocolos de células madre y de epitelios se escriben habitualmente en masa, por ejemplo 1 mg/mL para el pase de células madre pluripotentes humanas, a menudo en combinación con 1 mg/mL de colagenasa de tipo IV.

La documentación de los proveedores también difiere en cuanto al pH óptimo, con cifras que van de 5.9-7.0 hasta 8.5 según la ficha técnica. Lo que sí es constante entre fuentes es que la enzima es activa y estable en un amplio intervalo neutro, aproximadamente de pH 4 a 9, de donde procede el nombre de «proteasa neutra». En la práctica, realizar la digestión en una solución salina equilibrada estándar a pH fisiológico funciona, y no hace falta resolver la discrepancia entre los óptimos citados para obtener un resultado.

Preparación de una disolución madre. Una preparación habitual es de 5 mg/mL disueltos en agua de grado cultivo celular y pasados por un filtro de 0.2 µm para esterilizarlos. También se venden disoluciones estériles listas para usar, normalmente a 10 mg/mL, que evitan los pasos de pesada y filtración. En disolución, la dispasa se mantiene estable unos 12 meses a 2-8 °C; las disoluciones madre congeladas deben repartirse en alícuotas y descongelarse una sola vez.

Punto crítico: diluya en un tampón con calcio. La dispasa necesita calcio para su estabilidad estructural, y la concentración óptima de calcio ronda los 2 mM. Diluir la dispasa en PBS o DPBS sin calcio ni magnesio —el tampón al que se recurre con la tripsina-EDTA— desestabiliza progresivamente la enzima. Utilice HBSS o DPBS con calcio y magnesio, o un medio completo. Es la regla opuesta a la de la tripsina-EDTA y una causa frecuente de pérdida de actividad sin explicación aparente.

Protocolo 1: separación de la epidermis y la dermis. Los enfoques publicados abarcan un intervalo amplio de concentración y tiempo, intercambiando una por el otro:

1. Enjuague la muestra de piel y córtela en tiras de unos pocos milímetros de anchura.
2. Haga flotar el tejido con la cara dérmica hacia abajo sobre la disolución de dispasa. Dos condiciones de uso frecuente son 1 mg/mL en PBS a 37 °C durante unos 30 minutos, o una concentración mayor (500-1000 U/mL) con una incubación prolongada de hasta 24 horas; la incubación durante la noche a 4 °C durante 15-18 horas es una tercera opción muy utilizada y es la condición que indican algunas instrucciones de proveedor.
3. Traslade el tejido a una placa con tampón y despegue la lámina epidérmica de la dermis con pinzas finas. Debe levantarse como una lámina intacta.
4. Pase a una segunda enzima si desea queratinocitos individuales: en este punto se emplea normalmente tripsina-EDTA para disociar la lámina.

Protocolo 2: liberación de una monocapa epitelial intacta. Cuando el objetivo es una lámina y no una suspensión:

1. Aspire el medio y enjuague la monocapa con una solución salina equilibrada con calcio. No utilice un lavado que contenga EDTA.
2. Añada disolución de dispasa en cantidad suficiente para cubrir la superficie de crecimiento.
3. Incube a 37 °C y compruebe cada 10-15 minutos. La lámina empieza a levantarse por los bordes.
4. Recoja la lámina liberada aspirando con suavidad con una pipeta de boca ancha. No pipetee con energía: el sentido de usar dispasa es que la lámina se mantenga entera.

Protocolo 3: la dispasa como enzima secundaria. La dispasa se utiliza muy a menudo junto con colagenasa en la disociación de tejidos sólidos, donde la colagenasa ataca el colágeno intersticial fibrilar y la dispasa se ocupa de la membrana basal y de la fibronectina. Ambas suelen combinarse en la misma digestión, en un tampón con calcio a 37 °C y con agitación suave, con un tiempo que depende del tipo de tejido y del tamaño de los fragmentos.

La forma fiable de detener la dispasa es la quelación. Añadir EDTA o EGTA hasta una concentración final de aproximadamente 1 mM retira el zinc catalítico e inactiva la enzima. La 1,10-fenantrolina y los metales pesados también la inhiben. Es una parada química contundente y es fiable.

El suero no es una parada fiable, y las fuentes no coinciden al respecto. Algunos protocolos publicados frenan las digestiones con dispasa añadiendo un volumen igual de medio con 10% de suero y afirman que funciona. Parte de la documentación de proveedores, en cambio, señala que la dispasa no es inhibida por el suero, algo que se presenta como una ventaja, ya que permite emplear la enzima en medio completo. Ambas afirmaciones pueden ser parcialmente ciertas: el suero contiene inhibidores de proteasas de amplio espectro, pero la dispasa no es una serina proteasa, y los inhibidores de serina proteasas que detienen la tripsina de forma tan tajante no se aplican aquí. El inhibidor de tripsina de soja, en particular, no tiene ningún efecto sobre las metaloproteasas.

La postura práctica: no confíe solo en el suero para detener la dispasa. Si necesita que la reacción se detenga en un momento definido, quele. Si necesita eliminar la enzima, diluya y lave por centrifugación. El medio con suero sirve perfectamente como diluyente para ese lavado, pero considere que el trabajo lo hace la dilución y no el suero.

El corolario sorprende a mucha gente en el sentido contrario. Como los quelantes inactivan la dispasa, no se puede pasar directamente de un paso con EDTA —tripsina-EDTA, Versene o tampón de lisis ACK, que contiene EDTA— a una digestión con dispasa y esperar que la dispasa funcione. El EDTA residual la inhibirá, a veces por completo. Lave dos veces en un tampón con calcio entre ambos pasos.

Estas tres enzimas no son intercambiables, y elegir entre ellas es sobre todo una cuestión de qué mantiene unido el tejido y qué debe sobrevivir al proceso.

La tripsina es una serina proteasa con especificidad amplia por los enlaces peptídicos situados después de lisina y arginina. Es rápida, barata y eficaz, y es indiscriminada: corta las proteínas de la superficie celular junto con todo lo demás, de modo que los epítopos de superficie quedan dañados y las uniones intercelulares se destruyen. Produce suspensiones de células individuales, que a menudo es justo lo que se busca y a veces justo lo que no. Digiere mal el colágeno fibrilar, por lo que rinde poco en tejidos sólidos ricos en tejido conjuntivo.

La colagenasa, de Clostridium histolyticum, corta el colágeno nativo de triple hélice, algo que casi ninguna otra proteasa puede hacer. Es la enzima para tejidos sólidos con una matriz de colágeno intersticial abundante. La colagenasa comercial se suministra como mezclas que se distinguen por el equilibrio de sus actividades secundarias —clostripaína, caseinasa y actividad tríptica—, y las designaciones de tipo reflejan los tejidos a los que se ajusta cada mezcla. El tipo I es la mezcla de uso general para epitelio, hígado, pulmón, grasa y tejido suprarrenal; el tipo II tiene mayor actividad clostripaína y se adapta a corazón, hueso, músculo y cartílago; el tipo IV tiene baja actividad tríptica y se elige cuando importa la integridad de los receptores, clásicamente para islotes pancreáticos y adipocitos. Igual que la dispasa, la colagenasa es una metaloproteasa dependiente de calcio y la inhibe el EDTA.

La dispasa ocupa el espacio que no cubre ninguna de las dos: la membrana basal. No actúa sobre el colágeno fibrilar de tipo I en ningún grado útil ni arranca de forma agresiva la superficie celular, pero desmonta la fibronectina y el colágeno de tipo IV que anclan un epitelio a su sustrato. Por eso es la enzima para la separación dermoepidérmica y para liberar láminas epiteliales enteras, y por eso se combina tan a menudo con colagenasa en lugar de emplearse sola en tejidos sólidos.

La elección resulta más clara cuando lo que importa es la integridad de la lámina epitelial. Si quiere una lámina intacta, use dispasa y manipúlela con suavidad. Si quiere células individuales a partir de esa lámina, use primero dispasa y después tripsina-EDTA. Empezar con tripsina da células individuales, pero destruye las proteínas de unión que quizá quería estudiar, y usar solo colagenasa sobre la piel deshará la dermis sin liberar limpiamente la epidermis.

Almacenamiento. La dispasa liofilizada se mantiene estable unos 12 meses a 2-8 °C. Las disoluciones se conservan habitualmente congeladas y protegidas de la luz, y conviene repartirlas en alícuotas para descongelar una sola vez el volumen de trabajo en lugar de someterlo a ciclos. Como con cualquier proteasa, la congelación y descongelación repetidas provocan una pérdida autolítica de actividad que resulta invisible hasta que una digestión deja de funcionar sin motivo aparente.

Esterilidad y endotoxinas. Las preparaciones de dispasa son productos de fermentación bacteriana y una vía plausible de entrada de endotoxinas en una preparación de células primarias. Para células inmunitarias primarias, células madre o cualquier trabajo orientado a una aplicación regulada, utilice una preparación con especificación de endotoxinas declarada y disuelva el polvo en agua de grado cultivo celular, no en agua desionizada de laboratorio.

Problemas frecuentes

La digestión es lenta o no funciona. Compruebe primero el arrastre de quelantes: el EDTA residual de un paso anterior es la causa más habitual. Compruebe después si el diluyente contenía calcio; la dispasa diluida en PBS sin Ca/Mg pierde estabilidad. Compruebe por último la actividad específica del lote frente a la del lote para el que se escribió el protocolo.

La lámina epitelial se fragmenta en lugar de levantarse entera. Suele deberse a una digestión excesiva, a una manipulación mecánica demasiado brusca o a ambas cosas. Compruebe antes y con más frecuencia, y recoja con una pipeta de boca ancha en lugar de con una punta estándar.

La viabilidad celular es baja tras la disociación. La dispasa es suave en comparación con la tripsina, pero sigue siendo una proteasa, y las digestiones durante toda la noche a 37 °C son mucho tiempo para que las células permanezcan en enzima. Cuando el protocolo lo permita, una digestión prolongada a 4 °C es más benévola que la equivalente a 37 °C.

Los rendimientos varían entre lotes. Es el problema de las unidades descrito más arriba. Dosifique en unidades por mililitro, registre el lote y la actividad específica en el método y vuelva a titular cuando cambie el lote.

El ensayo posterior se comporta de forma extraña. La dispasa deja las proteínas de la superficie celular en gran medida intactas en comparación con la tripsina, pero «en gran medida» no es «del todo», y la fibronectina que corta forma parte de la matriz que las células necesitarán para volver a adherirse. Deje un periodo de recuperación en medio completo antes de los ensayos que dependan de la adhesión.