Subcultivo celular (pase)

Un recipiente de cultivo aporta un área de crecimiento fija y un volumen de medio fijo. A medida que las células se dividen consumen glucosa y glutamina, agotan la capacidad tampón del medio y acumulan lactato y amoníaco. Al mismo tiempo, una monocapa adherente se queda sin superficie libre. Una vez que la superficie está cubierta por completo, el cultivo es confluente, y a partir de ese momento la población ya no se encuentra en crecimiento exponencial equilibrado.

El subcultivo restablece ambas limitaciones a la vez. Las células se despegan (adherentes) o se diluyen (suspensión) y se distribuyen en recipientes nuevos a menor densidad con medio fresco, lo que devuelve la población a la fase logarítmica de la curva de crecimiento, donde el tiempo de duplicación es constante y la fisiología es reproducible.

Tres cosas distintas salen mal si un cultivo se deja pasar de la confluencia:

• Detención del crecimiento. Las líneas inhibidas por contacto, como NIH/3T3, dejan de dividirse cuando la monocapa se cierra y cuesta reactivarlas de forma limpia.
• Deriva fenotípica. Las líneas transformadas que no están inhibidas por contacto se apilan en multicapas, se desprenden en láminas y pueden seleccionar variantes que toleran el hacinamiento.
• Estrés metabólico. El medio vira a amarillo a medida que se acumula lactato y el tampón de bicarbonato se ve superado. El propio cambio de pH reduce la viabilidad y la eficiencia de siembra en el pase siguiente, incluso cuando las células vuelven a parecer normales en medio fresco.

El paso de subcultivo es también el momento en el que se realiza la mayor parte del trabajo rutinario de cultivo: el recuento, las comprobaciones de viabilidad, la criopreservación, el muestreo para micoplasmas y la preparación de placas experimentales suelen depender de un pase.

La confluencia es la fracción de la superficie de crecimiento cubierta por células, evaluada visualmente en un microscopio invertido de contraste de fases a 4x o 10x. Es una estimación visual, no una medida, así que requiere una convención de operador coherente.

El objetivo estándar es una confluencia del 70-80% en las líneas adherentes continuas. A esa densidad las células siguen en fase logarítmica, la viabilidad es alta y se recuperan rápido tras la división. Hacer el pase mucho antes desperdicia células y puede alargar la fase de latencia; hacerlo tarde cuesta viabilidad y reproducibilidad.

Señales prácticas de que un frasco está listo:

1. Cobertura. Al 70-80% la monocapa se ha cerrado sobre la mayor parte de la superficie, pero todavía se ven huecos claros entre colonias. Al 100% no queda ningún hueco y los bordes celulares forman un mosaico continuo.
2. Forma celular. Células bien extendidas, bien adheridas y refringentes, con bordes nítidos. Las células que han empezado a redondearse, granularse o vacuolizarse ya están estresadas.
3. Color del medio. Con rojo de fenol, un cultivo sano en fase logarítmica se sitúa en un tono naranja-rojo. Un viraje a amarillo-naranja entre cambios de medio suele indicar que el cultivo está lo bastante denso para dividirlo. Un viraje a rosa-púrpura en un frasco poco poblado suele señalar un crecimiento deficiente o un suministro de CO2 defectuoso en el incubador, y no que el cultivo esté listo.
4. Restos flotantes. Una población creciente de células redondas y brillantes en contraste de fases flotando sobre la monocapa indica que el cultivo ya ha pasado su mejor momento.

Algunas líneas tienen sus propias reglas. NIH/3T3 debe subcultivarse antes de alcanzar la confluencia -- dejar que llegue a confluencia selecciona variantes transformadas formadoras de focos y cambia la línea de forma permanente. Las cepas finitas de fibroblastos diploides humanos como MRC-5 suelen llevarse más cerca del 80-90%. Los cultivos primarios y las células madre suelen tener ventanas aún más estrechas, fijadas por el protocolo de diferenciación y no solo por la confluencia.

En los cultivos en suspensión la confluencia no es aplicable. El disparador equivalente es la concentración celular: cuente el cultivo al menos dos veces por semana y dilúyalo antes de que la densidad alcance el extremo superior del rango tolerado por la línea.

Los volúmenes que siguen corresponden a un frasco T-75 (75 cm2). Escale de forma aproximada con el área de crecimiento: un T-25 necesita alrededor de un tercio y un T-175 unas 2.3x. Atempere el medio a 37 grados C antes de usarlo; mantenga la Trypsin-EDTA a temperatura ambiente o atempérela brevemente, y no la deje a 37 grados C durante periodos largos, porque la tripsina se autoliza.

1. Revise el cultivo. Confirme una confluencia del 70-80% y que el medio esté claro, sin turbidez ni cambios de pH inesperados. Anote el número de pase en el frasco.
2. Retire el medio. Aspire y deseche todo el medio gastado. El suero residual es la razón principal por la que falla la tripsinización, porque el suero contiene alfa-1-antitripsina y otros inhibidores de proteasas.
3. Lave. Añada 5-10 mL de DPBS o PBS sin Ca2+/Mg2+, balancee suavemente sobre la monocapa y aspire. El calcio y el magnesio son necesarios para las adhesiones de cadherinas e integrinas que se pretende romper, así que el tampón de lavado debe estar libre de ambos. Lave dos veces si la línea se cultiva con suero alto.
4. Enjuague con tripsina (opcional pero útil). Añada 1-2 mL de Trypsin-EDTA, balancee para cubrir y aspire de inmediato. Esto elimina los últimos restos de la película de inhibidores.
5. Añada Trypsin-EDTA. Añada 2-3 mL de tripsina al 0.25% con EDTA 0.53 mM (o Trypsin-EDTA al 0.05% para líneas delicadas o poco adheridas) y balancee para que quede cubierta toda la superficie.
6. Incube. Devuelva el frasco a 37 grados C y compruébelo al microscopio a los 2 minutos, y después cada minuto. La mayoría de las líneas se despegan en 2-10 minutos; algunas líneas muy adherentes tardan hasta 15. No se limite a poner un temporizador y marcharse: la sobretripsinización es, con diferencia, la causa más frecuente de una recuperación deficiente.
7. Libere la lámina. Cuando las células estén redondeadas y la lámina empiece a deslizarse, golpee con firmeza el lateral del frasco contra la palma de la mano para desprenderla. Al microscopio debería ver una suspensión de células redondeadas individuales, no láminas ni hilos.
8. Neutralice. Añada 6-8 mL de medio de crecimiento completo con suero y pipetee con suavidad sobre la superficie de crecimiento para arrastrar las células residuales y dispersar los agregados. En los sistemas sin suero, use en su lugar un inhibidor de tripsina definido, como el inhibidor de tripsina de soja; el medio sin suero por sí solo no detiene la reacción.
9. Cuente si es necesario. Tome una alícuota para un recuento en hemocitómetro con azul de tripano. Contar en cada pase es una buena práctica y es obligatorio siempre que se especifique una densidad de siembra definida.
10. Centrifugación opcional. En líneas sensibles a la tripsina residual, o cuando se cambia el medio a una formulación distinta, centrifugue a 100-200 x g durante 5 minutos, deseche el sobrenadante y resuspenda en medio fresco. Omita este paso en líneas robustas: el ciclo de sedimentar y resuspender cuesta viabilidad.
11. Vuelva a sembrar. Distribuya la suspensión en frascos nuevos con la proporción de división o la densidad de siembra elegidas, complete hasta el volumen de trabajo (15-20 mL para un T-75) y etiquete con la línea, el nuevo número de pase y la fecha.
12. Devuelva al incubador. Balancee el frasco de delante hacia atrás y de lado a lado -- nunca lo agite en círculos, porque eso concentra las células en el centro -- y colóquelo plano a 37 grados C y 5% CO2.

Las células deberían estar adheridas y empezando a extenderse en 4-24 horas, según la línea.

Las líneas en suspensión no necesitan disociación, de modo que el pase es una dilución.

1. Cuente el cultivo y compruebe la viabilidad. Es la base entera de la decisión, así que no puede omitirse.
2. Resuspenda con suavidad mediante un movimiento circular suave o invirtiendo el recipiente, de forma que la alícuota que tome sea representativa.
3. Diluya en medio fresco atemperado hasta la concentración de siembra recomendada para la línea, habitualmente 1 x 10^5 a 3 x 10^5 células viables/mL en líneas linfoblastoides como Jurkat.
4. Como alternativa, recambio parcial de medio. En los cultivos densos, deje que las células sedimenten o centrifugue a 100-200 x g durante 5 minutos, retire una fracción fija del medio condicionado y sustitúyala por medio fresco. Algunas líneas crecen mejor si se conserva una proporción de medio condicionado.
5. Devuelva al incubador. Los cultivos agitados o en spinner vuelven a la plataforma a la velocidad de agitación validada; los cultivos estáticos en suspensión vuelven en posición plana.

Los dos modos de fallo son opuestos e igual de dañinos. Dejar que la densidad suba demasiado agota el medio y hace caer la viabilidad de forma brusca: los cultivos de Jurkat, por ejemplo, no deberían superar 3 x 10^6 células/mL. Diluir en exceso empuja el cultivo a una fase de latencia prolongada de la que algunas líneas nunca se recuperan del todo; si una línea se está reactivando o crece mal, divídala de forma más conservadora.

Una proporción de división expresa cuánto se diluyen las células: una división 1:4 reparte el contenido de un frasco confluente en cuatro frascos nuevos del mismo tamaño. Es rápida, no requiere recuento y sirve bien para líneas robustas y bien caracterizadas con un calendario fijo.

Una densidad de siembra, en células viables/cm2 o células/mL, es la instrucción más precisa. Exige un recuento, pero es reproducible entre operadores, tipos de recipiente y estimaciones de confluencia, y es lo que especifican los protocolos experimentales.

Ambas están ligadas por la densidad de confluencia de la línea. Si una línea alcanza la confluencia en torno a 1 x 10^5 células/cm2 y se divide 1:8, se están sembrando aproximadamente 1.25 x 10^4 células/cm2.

Elegir una proporción se reduce al tiempo de duplicación y al intervalo que se desea:

• Una línea con un tiempo de duplicación de 24 horas gana unas 3 duplicaciones (8x) en 72 horas, de modo que una división 1:8 el viernes la devuelve a la confluencia hacia el lunes.
• La misma línea dividida 1:4 estará lista en unas 48 horas.
• Las líneas de crecimiento lento y las cepas finitas solo toleran divisiones poco profundas, normalmente de 1:2 a 1:4, porque una división profunda las deja por debajo de la densidad a la que crecen bien, y porque cada pase de una cepa finita consume parte de una vida útil fija.

Dos advertencias prácticas. Primero, las proporciones de división no son aditivas entre formatos de recipiente: dividir un T-75 "1:4" en cuatro T-25 es en realidad una división 1:1.3 por área. Razone siempre en área de crecimiento o en células/cm2. Segundo, cuando una línea se recupera de nitrógeno líquido, reduzca la profundidad de la división en los dos o tres primeros pases; las células descongeladas tienen una eficiencia de siembra menor.

El número de pase cuenta los eventos de subcultivo. Se incrementa en uno cada vez que se divide el cultivo, con independencia de lo profunda que fuera la división. Es una convención de registro, no una medida de la edad biológica, y su significado depende por completo de las proporciones de división empleadas por el camino.

El nivel de duplicaciones de población (PDL) es la cifra con significado biológico: el número acumulado de veces que la población se ha duplicado. Para cada pase:

PD = 3.32 x [ log10(células cosechadas) - log10(células sembradas) ]

y el PDL es el total acumulado. Una división 1:2 suma una duplicación; una división 1:8 suma tres. Dos laboratorios que estén ambos en el "pase 20" pueden diferir en más de 40 duplicaciones.

Esto importa porque el comportamiento celular cambia con el tiempo en cultivo:

• Las cepas celulares finitas tienen una vida replicativa fija (el límite de Hayflick) y después entran en senescencia irreversible. ATCC indica que MRC-5 es capaz de 42 a 46 duplicaciones de población antes del inicio de la senescencia. A medida que la cepa se acerca a ese límite, el tiempo de duplicación se alarga, las células se agrandan y se aplanan, y la densidad de saturación cae.
• Las líneas celulares continuas son inmortales, pero no estables. El cariotipo, la expresión de receptores, la sensibilidad a fármacos, la eficiencia de transfección y la velocidad de crecimiento derivan a lo largo de pases prolongados. Las discrepancias publicadas entre laboratorios se remontan con frecuencia a stocks de pase alto.

El control estándar es un banco de dos niveles: un banco maestro congelado a pase bajo a partir del vial original y bancos de trabajo expandidos a partir de él. El cultivo rutinario se lleva desde un vial de trabajo durante un número definido de pases -- habitualmente 15-20, o 10 para ensayos sensibles -- y después se descarta y se descongela un vial nuevo. Registre el número de pase en cada frasco y en el registro de cultivo, y arrástrelo a todos los registros experimentales.

La lógica del subcultivo es la misma en ambos casos, pero casi todos los detalles prácticos difieren.

Los cultivos adherentes están limitados por el área de superficie, necesitan un paso de disociación, se cuentan solo en el pase y se escalan añadiendo recipientes o pasando a botellas rotatorias y frascos multicapa. El paso de disociación es donde se produce el daño: la tripsina corta proteínas de superficie, receptores incluidos, y la exposición prolongada reduce la viabilidad y retrasa la readhesión. Elegir el reactivo más suave que funcione -- Trypsin-EDTA al 0.05%, EDTA/Versene solo, o un reactivo de disociación recombinante o libre de enzimas -- suele compensar el minuto extra de incubación.

Los cultivos en suspensión están limitados por el volumen de medio y el intercambio de gases, no necesitan disociación, deben contarse de forma rutinaria y no solo en el pase, y escalan sin complicaciones por volumen a matraces agitados, spinners y biorreactores. Sus modos de fallo son la agregación, el daño por cizalla a alta agitación y la caída de densidad que sigue a un cultivo desbordado.

Algunas líneas existen en ambas formas. HEK293 y CHO son los ejemplos habituales: la línea adherente parental y el derivado adaptado a suspensión no son intercambiables, y la adaptación entre ambos lleva semanas de traspaso por etapas, no un solo pase.

Las células no se despegan. El suero residual es la causa habitual; lave otra vez con tampón sin Ca2+/Mg2+. Otras causas son una tripsina que ha perdido actividad por calentamientos repetidos o por ciclos de congelación y descongelación, una monocapa sobreconfluente con uniones célula-célula extensas, o una línea que simplemente necesita un reactivo más fuerte (0.25% en lugar de 0.05%, o una breve preincubación con EDTA).

Las células se despegan pero no se vuelven a adherir. Sobretripsinización. Los síntomas son una latencia larga, una eficiencia de adhesión baja y una fracción flotante creciente. Acorte la incubación, baje a tripsina al 0.05%, neutralice de inmediato y por completo, y valore un reactivo no enzimático.

Agregación tras la disociación. Suele deberse al ADN liberado por las células lisadas. Añada una concentración baja de DNasa al medio de neutralización, o reduzca el tiempo de tripsinización. Los agregados arruinan tanto los recuentos celulares como la uniformidad de la siembra.

Monocapa desigual, con células apiladas en el centro o en los bordes. El frasco se agitó en círculos en lugar de balancearlo, o se movió antes de que las células sedimentaran. Balancee de delante hacia atrás y luego de lado a lado, y deje el frasco apoyado sin moverlo.

El crecimiento se ralentiza a lo largo de pases sucesivos. Compruebe primero el PDL: una cepa finita puede estar simplemente acercándose a la senescencia. Si no, sospeche de micoplasma (invisible a simple vista y la causa más frecuente de un crecimiento lento inexplicado), de un lote de suero defectuoso, de una deriva del CO2 o de la humedad del incubador, o de un daño acumulado por sobretripsinización.

El cultivo alcanza la confluencia demasiado rápido o demasiado despacio. La proporción de división ya no se ajusta al tiempo de duplicación, que a su vez cambia a medida que la línea deriva. Vuelva a contar, recalcule la densidad de siembra y ajústela en lugar de mantener la proporción histórica.

Aparece una contaminación en un pase concreto. Rastree hasta los frascos de reactivos compartidos que se abrieron en esa sesión. Fraccione los medios y los suplementos en volúmenes de un solo uso para que un episodio de contaminación no pueda propagarse por todo un banco.