El rojo de fenol en los medios de cultivo celular

El rojo de fenol, químicamente fenolsulfonftaleína, es un colorante de la familia de las sulfonftaleínas con una masa molecular de 354,4 en su forma de ácido libre y de 376,4 en la forma de sal sódica que se emplea en la formulación de los medios. Se incluye en la mayoría de los medios de cultivo celular clásicos por un solo motivo: es un indicador de pH cuyo intervalo de viraje abarca justamente el pH al que se cultivan las células de mamífero.

Conviene dejar claro lo que no es. El rojo de fenol no es un tampón. A los 5-15 mg/L que hay en los medios está presente a unos 13-40 micromolar, frente a 24-44 milimolar de bicarbonato de sodio: tres órdenes de magnitud menos. No aporta nada medible a la estabilidad del pH del medio. Es una lectura, no un control.

Tampoco es un nutriente, ni un suplemento, ni algo que las células necesiten. Todos los medios clásicos están disponibles en una versión sin rojo de fenol, y las células crecen en esas versiones exactamente igual que en las coloreadas. El colorante existe únicamente para que quien pase junto a un incubador pueda ver, en un segundo y sin abrir nada, si un cultivo va en la dirección equivocada.

La concentración no está normalizada entre formulaciones, y por eso el mismo tono de naranja significa cosas ligeramente distintas en medios distintos, y por eso el color del RPMI nunca se parece del todo al del DMEM.

El F-12 de Ham es el caso atípico, con 1,2 mg/L, y por eso se ve pálido y descolorido en comparación con el DMEM, y por eso el DMEM/F-12 —la mezcla 1:1— queda en un punto intermedio, con 8,1 mg/L. Si compara el color entre frascos, compare únicamente frascos que contengan el mismo medio.

Algunas soluciones salinas equilibradas llevan rojo de fenol y otras no. El HBSS se vende en ambas formas; el PBS y el DPBS se suministran normalmente sin él.

El rojo de fenol presenta un viraje gradual de amarillo a rojo entre pH 6,8 y 8,2, con un pKa comunicado entre aproximadamente 7,7 y 8,0. La forma ácida absorbe al máximo cerca de 443 nm y la forma básica cerca de 570 nm, lo que da al colorante sus dos aspectos tan diferentes.

La costumbre importante es comparar frente a una referencia. Sostenga el frasco sobre un fondo blanco junto a un frasco del mismo medio recién preparado y a la misma temperatura. El color juzgado de forma aislada, entre dos medios distintos o sobre una mesa de trabajo de color no es fiable. La tabla comparativa que figura más abajo recoge la interpretación práctica.

Una advertencia antes de actuar según el color: la lectura es semicuantitativa y va con retraso. Un cultivo puede estar metabólicamente estresado antes de que el medio cambie de forma visible, y el cambio que finalmente se aprecia refleja la carga ácida acumulada durante horas, no el estado actual de las células. Tome el color como un aviso para mirar por el microscopio, no como un diagnóstico en sí mismo.

Amarillo significa ácido y, en cultivo celular, ácido significa casi siempre lactato. Las células en cultivo mantienen una elevada tasa de glucólisis aerobia y exportan lactato al medio; los protones que lo acompañan titulan a la baja el tampón de bicarbonato y, una vez que el pH cae por debajo de aproximadamente 6,8, el indicador está por completo en su forma amarilla.

Las causas frecuentes, aproximadamente por orden de frecuencia:

El cultivo simplemente está denso. Una monocapa confluente o con exceso de confluencia, o un cultivo en suspensión cerca de su densidad máxima, produce lactato suficiente para volver amarillo el medio en un día. Es biología normal y la respuesta es alimentar o pasar el cultivo. Si un frasco se pone amarillo sistemáticamente antes del siguiente cambio de medio previsto, siembre menos células o alimente con más frecuencia.

El cultivo se ha dejado demasiado tiempo. El agotamiento del medio durante un fin de semana es el caso clásico. La glucosa baja, el lactato se acumula y el cultivo permanece en medio ácido el tiempo suficiente para que la viabilidad caiga aunque después se añada medio fresco.

Contaminación bacteriana. Las bacterias acidifican el medio mucho más deprisa que las células de mamífero y suelen enturbiarlo al mismo tiempo. La señal característica es un medio que ayer estaba bien y hoy está amarillo intenso y turbio, a menudo con partículas móviles visibles a gran aumento. Descarte, no intente rescatarlo y revise todo lo que se manipuló en la misma sesión.

Demasiado CO2, o un medio inadecuado para el incubador. Un medio formulado para 5% de CO2 utilizado al 10% estará ácido desde el principio. Ajuste el bicarbonato a la atmósfera: los medios por debajo de aproximadamente 1,5 g/L de bicarbonato de sodio son adecuados para aire ambiente o 4% de CO2, los de 1,5-2,2 g/L para el 5% y los de más de 3,5 g/L para el 10%. El DMEM con 3,7 g/L está formulado para 10% de CO2 y funcionará ligeramente ácido en un incubador al 5% respecto a su punto de diseño, algo que la mayoría de los laboratorios aceptan sin problema, pero conviene saberlo cuando un frasco se ve anaranjado desde el primer día.

Rosa o fucsia significa alcalino y, en un medio tamponado con bicarbonato, la alcalinidad significa casi siempre que el CO2 ha abandonado el sistema. El bicarbonato sigue ahí; el ácido carbónico que lo equilibraba ha escapado en forma de gas y el pH sube.

Medio sacado del incubador. Es, con diferencia, la falsa alarma más habitual. Un frasco llevado a la mesa de trabajo empieza a perder CO2 de inmediato y se vuelve visiblemente rosado en cuestión de minutos. No dice nada sobre el cultivo. Juzgue el color en frascos recién sacados del incubador, o asuma que todo lo que fotografíe en la mesa parecerá más alcalino de lo que es.

El incubador no está aportando CO2. Una botella vacía, una válvula cerrada, un regulador averiado o un sensor descalibrado volverán rosados a la vez todos los frascos del incubador. Si todos sus cultivos se han puesto rosados al mismo tiempo, sospeche del incubador antes que de las células, y compruebe la lectura de CO2 con un medidor independiente, porque un sensor mal calibrado indicará el valor de consigna sin aportar nada.

La puerta ha estado abierta o el incubador está sobrecargado. Aperturas frecuentes o prolongadas de la puerta impiden recuperar el valor de consigna. Los frascos situados cerca del frente se ponen rosados primero.

Tapones flojos o recipiente inadecuado. Los tapones con filtro están diseñados para equilibrarse con la atmósfera del incubador. Un tapón hermético sobre un medio con bicarbonato dentro de un incubador de CO2 impide el equilibrio; un tapón con filtro en un cultivo sobre la mesa deja escapar el CO2. Ajuste el tipo de tapón al lugar donde vive el cultivo.

Bicarbonato demasiado alto para la atmósfera. La imagen simétrica del caso ácido: una formulación con sales de Earle a 2,2 g/L de bicarbonato, o el DMEM a 3,7 g/L, dejados al aire ambiente se alcalinizarán rápidamente. Las formulaciones con sales de Hanks a 0,35 g/L son las diseñadas para mantener el pH al aire.

Algunos contaminantes alcalinizan. Una minoría de los organismos contaminantes eleva el pH en lugar de bajarlo. Rosa más turbidez sigue siendo contaminación mientras no se demuestre lo contrario.

Hay dos modos de fallo lo bastante importantes como para enunciarlos con claridad.

El micoplasma no suele producir cambio de color ni turbidez. Los cultivos infectados por micoplasma a menudo parecen completamente normales —medio transparente, color esperado, células que crecen— mientras el organismo altera el metabolismo, la expresión génica y los resultados experimentales. El color es inútil como cribado de micoplasma. El único enfoque fiable es el ensayo rutinario por PCR o mediante un método de detección específico, con una periodicidad fija.

Un color normal no significa que el medio esté nutricionalmente intacto. La glucosa puede estar sustancialmente agotada y la glutamina puede degradarse a amoniaco sin que el indicador se desplace demasiado. El rojo de fenol informa del balance de protones y de nada más. Un cultivo que por color parece correcto puede estar igualmente en ayunas.

Hay además un límite práctico que conviene recordar: el rojo de fenol no distingue entre un cultivo sano y denso y uno contaminado. Ambos vuelven amarillo el medio. Es el microscopio, y no el color, el que le dice cuál es cuál.

El rojo de fenol interfiere en las mediciones ópticas, y esa es la razón principal para eliminarlo.

Ensayos de absorbancia. El colorante absorbe intensamente cerca de 443 nm y de 570 nm. Ese segundo máximo coincide justo con las longitudes de onda de lectura de varios ensayos colorimétricos estándar —el MTT se lee habitualmente a 570 nm y el ensayo de nitritos de Griess en torno a 540 nm—, de modo que el rojo de fenol residual infla el blanco y comprime el intervalo dinámico. Aun cuando el ensayo incluya un blanco de medio, un fondo coloreado resta sensibilidad y, como la absorbancia del colorante depende a su vez del pH, el fondo varía con el estado metabólico del pocillo. Ese último punto es el que arruina placas de forma silenciosa: un pocillo activo y uno tranquilo tienen fondos distintos.

Mediciones de fluorescencia. El rojo de fenol aporta un fondo amplio en el intervalo del verde al naranja y puede apagar la señal por efectos de filtro interno. La microscopía de células vivas, los ensayos en lector de placas por fluorescencia y la citometría de flujo de células que aún conservan medio se benefician todos de las formulaciones sin rojo de fenol. Para microscopía, la elección habitual es un medio sin rojo de fenol con HEPES, ya que además mantiene el pH en una platina de microscopio fuera de una atmósfera de CO2.

Trabajo con células sensibles a los estrógenos. Se trata en el apartado siguiente.

Biofabricación y procesamiento posterior. Cuando un componente del medio debe eliminarse del producto, un colorante innecesario es un problema de eliminación innecesario, y las formulaciones sin rojo de fenol son lo habitual en los medios de producción.

Algunos flujos de trabajo de espectrometría de masas y metabolómica, donde el colorante y sus impurezas aparecen como iones contaminantes.

Conviene enunciarlo con precisión, porque se repite mucho de forma distorsionada.

Berthois, Katzenellenbogen y Katzenellenbogen comunicaron en 1986 que las preparaciones de rojo de fenol muestran una actividad estrogénica medible a 15-45 micromolar, que es exactamente el intervalo en el que el colorante está presente en los medios de cultivo. Observaron unión al receptor de estrógenos de células de cáncer de mama humano MCF-7 con una afinidad en torno al 0,001% de la del estradiol (Kd de aproximadamente 2 x 10^-5 M) y una estimulación dependiente de la dosis de la proliferación en células MCF-7 positivas para el receptor de estrógenos, pero no en células MDA-MB-231 negativas para el receptor.

Dos años después, Bindal y sus colaboradores demostraron mediante HPLC y reparto entre disolventes que la unión al receptor y la actividad promotora del crecimiento no corresponden a la propia fenolsulfonftaleína, sino a impurezas más lipófilas presentes en las preparaciones comerciales —una de ellas identificada como bis(4-hidroxifenil)[2-(fenoxisulfonil)fenil]metano—, y que había cantidades interferentes en muchas preparaciones disponibles comercialmente. Trabajos relacionados también atribuyeron a una impureza lipófila los efectos sobre el transporte de cationes.

La conclusión práctica es la misma en ambos casos y no depende de qué molécula sea la responsable: si estudia respuestas a estrógenos, o cualquier proceso situado por debajo de la señalización del receptor de estrógenos, utilice medio sin rojo de fenol. La combinación estándar es medio sin rojo de fenol con suero tratado con carbón activado, que elimina tanto la actividad asociada al colorante como los esteroides aportados por el suero. La pureza de un lote concreto de rojo de fenol no es algo que pueda comprobarse en la mesa de trabajo, así que eliminar la variable es más fiable que dar por supuesto que el lote está limpio.

Para células sin receptor de estrógenos y sin interés por esa vía, esto no es motivo para cambiar de medio.

Prescindir del rojo de fenol le cuesta la señal de pH gratuita, continua y visible de un vistazo, y los laboratorios que cambian suelen subestimar hasta qué punto dependían de ella. Los frascos contaminados se detectan más tarde, y el medio agotado, más tarde todavía.

Merece la pena establecer tres compensaciones. Fije el calendario de alimentación en lugar de alimentar a ojo, basándose en una curva de crecimiento de esa línea a esa densidad de siembra. Mida el pH directamente cuando importe: un medidor calibrado sobre una alícuota de medio agotado lleva un minuto. Y mantenga un frasco de control con medio coloreado de la misma línea y con el mismo calendario si está realizando un experimento largo sin rojo de fenol, para disponer de una referencia visual de cuándo requieren atención los cultivos sin colorear.

Añadir HEPES a 10-25 mM es un cambio que suele acompañar al trabajo sin rojo de fenol, ya que mantiene el pH fuera de un incubador de CO2 durante la microscopía o una manipulación prolongada. El HEPES no sustituye al indicador —aborda la estabilidad, no la visibilidad— y tiene sus propias consideraciones, incluida la fototoxicidad bajo iluminación.

Una última confusión que conviene aclarar: el rojo de fenol aparece también en microbiología como indicador en los caldos de fermentación de carbohidratos, que es una aplicación distinta en un contexto distinto. El material de esta página se refiere al rojo de fenol como indicador de pH en los medios de cultivo de células de mamífero.