EMEM frente a DMEM: qué cambió realmente la modificación

Buena parte de la confusión que hay detrás de esta pregunta es de nomenclatura, no de química.

EMEM corresponde a Eagle's Minimum Essential Medium, el medio mínimo esencial de Eagle. MEM corresponde a Minimum Essential Medium, medio mínimo esencial. Ambos nombran la misma formulación: la que publicó Harry Eagle en 1959. ATCC etiqueta su versión como EMEM; Gibco, Sigma y la mayoría de los demás proveedores etiquetan la suya como MEM. Un protocolo que pide EMEM está pidiendo MEM, y al revés.

Lo que no es idéntico es el frasco. Los proveedores modifican la formulación base y las diferencias son reales:

• El MEM de Gibco (11095) contiene sales de Earle con 2.2 g/L de bicarbonato de sodio, 1.0 g/L de glucosa y 2 mM de L-glutamina, sin aminoácidos no esenciales y sin piruvato de sodio.
• El EMEM de ATCC (30-2003) contiene sales de Earle con solo 1500 mg/L de bicarbonato de sodio, y añade aminoácidos no esenciales, 2 mM de L-glutamina y 1 mM de piruvato de sodio. Su especificación es pH 7.0-7.4 y osmolalidad de 260-320 mOsm/kg.

Así que un EMEM de ATCC ya contiene los aminoácidos no esenciales que quien usa un MEM de Gibco tiene que añadir a partir de un suplemento 100X, y lleva un tercio menos de bicarbonato. Si cambia de proveedor y sus cultivos empiezan a comportarse de otra manera, este es el primer sitio donde mirar. Lea siempre la línea de la modificación en la etiqueta en lugar de fiarse de las cuatro letras.

Harry Eagle estableció el conjunto mínimo de nutrientes que las células de mamífero en cultivo no pueden fabricar por sí mismas. El Basal Medium Eagle llegó primero, en 1955; el medio mínimo esencial le siguió en 1959, con un complemento de aminoácidos revisado y algo más rico. La filosofía del diseño está en el propio nombre: el mínimo que funciona, no el máximo que ayuda.

Renato Dulbecco y Gordon Freeman modificaron el medio de Eagle en 1959 con un propósito concreto: hacer crecer fibroblastos de embrión de ratón para sostener ensayos de placa del virus del polioma. Esa aplicación necesitaba células creciendo a pleno rendimiento, así que la modificación enriqueció casi todo. El resultado fue el medio de Eagle modificado por Dulbecco.

Esta historia explica el carácter de los dos medios. El EMEM es austero y se diseñó como un mínimo definido. El DMEM es rico y se diseñó para forzar la proliferación. Ninguno es mejor: se construyeron con especificaciones distintas, y el correcto depende del comportamiento que necesiten sus células.

La afirmación habitual de que el DMEM tiene cuatro veces los aminoácidos del MEM es falsa, y acertar en esto importa si se está razonando sobre limitación de nutrientes. Comparando las formulaciones de Gibco componente a componente:

Vitaminas: cuatro veces más, casi exactamente. El cloruro de colina, el D-pantotenato de calcio, el ácido fólico, la niacinamida y el clorhidrato de tiamina pasan todos de 1 mg/L en el MEM a 4 mg/L en el DMEM. La riboflavina pasa de 0.1 a 0.4 mg/L, y el i-inositol de 2 a 7.2 mg/L. Hay además una sustitución, y no un aumento: el MEM usa clorhidrato de piridoxal y el DMEM, clorhidrato de piridoxina.

Aminoácidos: alrededor del doble, con excepciones. La leucina, la isoleucina, la lisina, la metionina, la fenilalanina, la treonina, la tirosina, la valina y la cistina están todas cerca de duplicarse: la leucina pasa de 52 a 105 mg/L y la metionina, de 15 a 30. Pero la arginina baja, de 126 mg/L en el MEM a 84 en el DMEM. La histidina es idéntica, 42 mg/L en ambos. El triptófano solo sube de 10 a 16 mg/L.

Glutamina: el doble, de 292 mg/L (2 mM) a 584 mg/L (4 mM).

Glicina y serina: añadidas. El MEM no contiene ninguna de las dos; el DMEM contiene ambas a 0.4 mM. Son los dos únicos aminoácidos no esenciales que lleva el DMEM: no incluye ninguno de los otros cinco del conjunto NEAA estándar.

Glucosa: igual o cuadruplicada, según la versión. El MEM contiene 1.0 g/L. El DMEM de baja glucosa contiene también 1.0 g/L; el DMEM de alta glucosa contiene 4.5 g/L (25 mM).

Bicarbonato de sodio: bastante más alto, de 2.2 g/L (26.2 mM) en el MEM de Gibco a 3.7 g/L (44.0 mM) en el DMEM. El cloruro de sodio baja en la misma medida, de 6.8 a 6.4 g/L, para mantener la osmolalidad dentro del intervalo.

Nitrato férrico añadido a 0.1 mg/L, una fuente de hierro de la que el MEM carece por completo.

Rojo de fenol más alto, de 10 a 15 mg/L, y por eso el DMEM simplemente se ve más rojo que el MEM al mismo pH.

Por lo demás, la base salina es común: ambos llevan cloruro de calcio a 1.8 mM, sulfato de magnesio a 0.81 mM y cloruro de potasio a 5.33 mM.

El MEM se vende sobre dos bases salinas distintas, y esto hace tropezar más a menudo que las diferencias en aminoácidos.

El MEM con sales de Earle es la versión estándar. Su componente salino es exactamente la solución salina equilibrada de Earle: 2.2 g/L de bicarbonato de sodio, 6.8 g/L de cloruro de sodio, 0.4 g/L de cloruro de potasio, 140 mg/L de fosfato de sodio monobásico y 1.0 g/L de glucosa, más calcio y magnesio. Está diseñado para un incubador de CO2, convencionalmente al 5%.

El MEM con sales de Hanks sustituye esa base por la HBSS, cuyo bicarbonato es de solo 0.35 g/L. Esa formulación está diseñada para mantener el pH en aire ambiente, en un recipiente cerrado y sin incubador de CO2.

El DMEM se fabrica únicamente sobre una base derivada de la de Earle, y modificada: más bicarbonato, algo menos de cloruro de sodio y de fosfato, y el nitrato férrico añadido. No existe un DMEM con sales de Hanks, porque 3.7 g/L de bicarbonato y el aire ambiente son incompatibles por diseño.

La regla que conecta todo esto es que el bicarbonato debe ajustarse a la atmósfera. Los proveedores indican aproximadamente: por debajo de 1.5 g/L para aire ambiente o 4% de CO2, de 1.5-2.2 g/L para el 5%, de 2.2-3.4 g/L para el 7% y por encima de 3.5 g/L para el 10%. El DMEM de Gibco, a 3.7 g/L, está formulado para un 10% de CO2. La mayoría de los laboratorios lo usan igualmente al 5% y funciona, pero entonces el medio está por encima del pH para el que fue diseñado, y por eso un frasco de DMEM puede verse rosado desde el día en que se abre. El EMEM de ATCC, a 1.5 g/L, está especificado explícitamente para un 5% de CO2 en aire, y ATCC señala que a mayor CO2 puede hacer falta más bicarbonato.

Si traslada una línea celular de EMEM a DMEM sin pensar en el incubador, solo el desplazamiento de pH puede explicar el cambio de crecimiento que observe.

Empiece por la recomendación del banco de células. ATCC, ECACC, DSMZ y JCRB publican cada uno un medio concreto para cada línea depositada, y esas recomendaciones reflejan las condiciones en las que se caracterizó la línea. Desviarse es legítimo, pero cambia la velocidad de crecimiento, la morfología y a menudo el fenotipo, y hace que sus datos sean más difíciles de comparar con el trabajo publicado sobre esa misma línea.

El EMEM/MEM encaja con células adherentes de crecimiento lento y demanda metabólica moderada: cepas de fibroblastos diploides como MRC-5 y WI-38, muchas células primarias, células Vero y buena parte de la virología clásica, donde el MEM ha sido durante décadas el medio estándar para la célula hospedadora. ATCC recomienda EMEM para un gran número de líneas adherentes, incluida HeLa. Su composición más austera es una ventaja cuando se quiere que las células crezcan de forma constante y no lo más deprisa posible, y cuando al ensayo le importa tener un fondo mínimo y definido.

El DMEM encaja con líneas de proliferación rápida y alta demanda metabólica: HEK293 y sus derivadas, NIH/3T3, COS, muchas líneas transformadas y transfectadas, y la mayor parte del trabajo de transfección transitoria y de producción de virus. La glutamina, las vitaminas y —en la versión de alta glucosa— el carbono adicionales son justo lo que consumen esas células.

El DMEM de alta o de baja glucosa es una decisión aparte. La alta glucosa (4.5 g/L) sostiene el crecimiento a alta densidad, la transfección y la producción de virus, y es el estándar para hibridomas. La baja glucosa (1.0 g/L) se prefiere para hepatocitos primarios, para células cuyo metabolismo se está estudiando y allí donde la acumulación de lactato y la acidificación rápida son un problema. Tenga en cuenta que el DMEM de baja glucosa sigue llevando 3.7 g/L de bicarbonato: bajar la glucosa no cambia la necesidad de CO2.

El MEM alfa merece conocerse como tercera opción. Es una modificación adicional del MEM que lleva más aminoácidos, incluido el conjunto de los no esenciales, vitaminas adicionales, piruvato de sodio y ácido lipoico, y se vende con o sin nucleósidos y desoxirribonucleósidos. Es la opción estándar para las células estromales mesenquimales y para buena parte del trabajo hematopoyético, y en riqueza está más cerca del DMEM que del MEM simple.

Sustituir EMEM por DMEM uno por uno es el error habitual, y las consecuencias son previsibles y no misteriosas.

Pasar de EMEM a DMEM de alta glucosa multiplica la glucosa por 4.5, la glutamina por dos y las vitaminas por cuatro, todo a la vez. Las células responden creciendo más deprisa y produciendo mucho más lactato, de modo que el medio se acidifica antes y hay que alimentarlo con más frecuencia. Las curvas de crecimiento, los tiempos de duplicación, las densidades de siembra y todos los calendarios derivados de ellos se desplazan. Si el incubador se queda al 5% de CO2, el bicarbonato más alto sitúa además el pH de partida por encima de donde estaba.

En sentido contrario, de DMEM a EMEM, las células que dependían de ese fondo más rico pueden ralentizarse o detenerse; y si el cambio es hacia un MEM de Gibco en lugar de un EMEM de ATCC, habrá retirado también, sin pretenderlo, los aminoácidos no esenciales y el piruvato.

Tres reglas hacen segura la transición. Adapte de forma gradual, a lo largo de dos o tres pases, usando mezclas intermedias en lugar de un cambio brusco único. No cambie nunca de medio en mitad de un experimento ni entre un experimento y su control. Y vuelva a establecer la curva de crecimiento después de adaptar, porque todos los números que vienen después —densidad de siembra, intervalo de alimentación, día de recogida— se derivaron del medio anterior.

Si pasa del MEM de un proveedor a una formulación sin aminoácidos no esenciales, vuelva a añadirlos a 1X a partir de un suplemento 100X, lo que aporta 0.1 mM de cada uno de los siete. Esa única adición explica buena parte de la diferencia aparente entre un EMEM de ATCC y un MEM simple.