DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco)

El DMEM fue descrito por Renato Dulbecco y Gordon Freeman en 1959 como una modificación del medio de Harry Eagle para los ensayos de placa del virus del polioma. El cambio fue deliberadamente sencillo: tomar la formulación de Eagle y usar una «concentración cuádruple de aminoácidos y vitaminas». El propio medio esencial mínimo de Eagle, publicado ese mismo año, ya había establecido el conjunto mínimo de nutrientes que necesita una célula de mamífero en cultivo: trece aminoácidos esenciales, ocho vitaminas, glucosa y las seis sales inorgánicas de la solución salina equilibrada de Earle.

Elevar esas concentraciones importaba porque el MEM de Eagle estaba diseñado para ser mínimo. Los cultivos lo agotaban con rapidez y había que renovarlo a menudo. Cuadruplicar los aminoácidos y las vitaminas dio como resultado un medio que sostiene densidades celulares mayores entre cambios de medio, que es exactamente lo que necesita un virólogo que cuenta placas a lo largo de varios días.

El DMEM comercial actual no es literalmente un MEM 4x en todos sus componentes. Los proveedores añadieron glicina, serina y nitrato férrico, y modificaron el equilibrio salino: el bicarbonato de sodio pasó de 2200 a 3700 mg/L y el cloruro de sodio bajó de 6800 a 6400 mg/L para compensar la osmolalidad. El medio que hoy se vende como «DMEM» es un estándar estable y bien caracterizado, pero es un estándar comercial y no la receta literal de 1959.

Son los dos medios basales más utilizados en cultivo celular, y la pregunta de cuál usar surge constantemente. No son intercambiables, y las diferencias son estructurales, no cosméticas.

La decisión suele reducirse a tres preguntas.

¿El cultivo es adherente o está en suspensión? Los 1.8 mM de calcio del DMEM favorecen una adhesión firme; los 0.42 mM del RPMI se mantuvieron deliberadamente bajos para que las células linfoblastoides permanecieran en suspensión. Las líneas fibroblásticas y epiteliales adherentes van en DMEM; las células linfoides y hematopoyéticas en suspensión, en RPMI.

¿Qué dice el protocolo de referencia de la línea? Para las líneas establecidas esto no es una preferencia. Cambiar una línea entre DMEM y RPMI modifica el tiempo de duplicación, la densidad de saturación y con frecuencia la expresión de proteínas, lo que invalida la comparación con la bibliografía publicada salvo que se vuelva a caracterizar la línea después.

¿Cuánta demanda metabólica tiene el cultivo? El DMEM, con 25 mM de glucosa y aproximadamente cuatro veces la concentración de aminoácidos del RPMI, está pensado para cultivos densos, rápidos y de alta demanda. El RPMI está pensado para células que crecen a velocidad moderada durante días, y los cultivos densos lo agotarán antes.

Ninguno de los dos medios es sin más más rico que el otro. El DMEM gana en aminoácidos y glucosa; el RPMI gana en vitaminas, capacidad tamponante del fosfato y su inusual contenido de glutatión reducido.

La tabla siguiente recoge la formulación estándar del DMEM con glucosa alta (la formulación de referencia empleada por los principales proveedores, correspondiente al Gibco 11965 y a los productos de la clase Sigma D5796). El DMEM con glucosa baja es idéntico salvo que la D-glucosa está a 1000 mg/L en lugar de 4500 mg/L.

Sales inorgánicas y componentes mayoritarios

Aminoácidos (mg/L)

Glicina 30; L-arginina·HCl 84; L-cistina·2HCl 63; L-histidina·HCl·H2O 42; L-isoleucina 105; L-leucina 105; L-lisina·HCl 146; L-metionina 30; L-fenilalanina 66; L-serina 42; L-treonina 95; L-triptófano 16; sal disódica dihidratada de L-tirosina 104; L-valina 94.

Vitaminas (mg/L)

Cloruro de colina 4; D-pantotenato de calcio 4; ácido fólico 4; niacinamida 4; piridoxina·HCl 4; tiamina·HCl 4; i-inositol 7.2; riboflavina 0.4.

Fíjese en lo que falta. El DMEM no contiene aminoácidos no esenciales más allá de la glicina y la serina: nada de alanina, asparagina, aspartato, glutamato ni prolina. No contiene nucleósidos, ni biotina, ni vitamina B12, ni ácido lipoico. Su único metal traza es una cantidad simbólica de nitrato férrico. Se espera que todo lo demás que necesita la célula lo aporte el suero. Este es el hecho estructural más importante del DMEM: es una base rica en aminoácidos y vitaminas construida sobre el supuesto de que el suero aportará los lípidos, los elementos traza, las proteínas transportadoras y los factores de crecimiento.

Los dos niveles de glucosa no son opciones por defecto intercambiables, y escoger una por costumbre es una causa frecuente de datos no reproducibles.

La glucosa alta (4500 mg/L, 25 mM) es aproximadamente cinco veces la glucemia fisiológica. Úsela para líneas transformadas de crecimiento rápido, para transfección transitoria y producción de virus en HEK293, para hibridomas y para cualquier cultivo que quiera llevar a densidad elevada sin alimentarlo con frecuencia. La glucosa adicional actúa como reserva de nutrientes. El precio es que las células cultivadas a 25 mM de glucosa se apoyan mucho en la glucólisis, acidifican el medio más rápido por acumulación de lactato y pueden mostrar un fenotipo glucolítico que es un artefacto del medio y no de la biología que se está estudiando.

La glucosa baja (1000 mg/L, 5.6 mM) se aproxima a la glucemia humana normal. Úsela para hepatocitos primarios, para células estromales mesenquimales —donde la glucosa alta tiene efectos documentados sobre la diferenciación—, para cultivos prolongados o de diferenciación y para cualquier estudio metabólico en el que no quiera la glucólisis funcionando al máximo. El DMEM con glucosa baja es también la opción más apropiada cuando se comparan el metabolismo oxidativo y el glucolítico, porque 25 mM de glucosa suprimen la fosforilación oxidativa por el efecto Crabtree en muchas líneas transformadas.

El DMEM sin glucosa existe por la misma razón: permite fijar uno mismo la fuente de carbono, sustituyendo la glucosa por galactosa para forzar el metabolismo oxidativo (un enfoque estándar en el cribado de toxicidad mitocondrial) o ajustando la glucosa a un nivel definido.

Si va a cambiar el nivel de glucosa de un cultivo establecido, hágalo de forma gradual y vuelva a establecer su curva de crecimiento. El tiempo de duplicación, la confluencia en el momento del pase y la eficiencia de transfección cambian todos ellos.

La mayor parte de la confusión al pedir DMEM procede de cuatro opciones independientes que los proveedores combinan libremente.

Glutamina. La L-glutamine a 4 mM es lo estándar, pero se degrada en solución: se cicla a ácido pirrolidona carboxílico y libera amoníaco, con una semivida de unas pocas semanas a 4 °C y mucho menor a 37 °C. El DMEM sin glutamina permite añadirla recién preparada en el momento de uso, o sustituirla por una forma dipeptídica (L-alanil-L-glutamina), estable en solución y que libera glutamina lentamente a medida que las células la escinden. Para cualquier cultivo mantenido más de una semana sin un cambio completo de medio, el dipéptido es la mejor opción.

Piruvato de sodio. A 1 mM, el piruvato aporta un sustrato energético adicional y un pequeño beneficio antioxidante. Resulta realmente útil para células a baja densidad o con poco suero, donde mejora la eficiencia de siembra. Déjelo fuera si va a hacer estudios de flujo metabólico, en los que una reserva de piruvato no marcado complica la interpretación del trazador.

Rojo de fenol. Es un indicador de pH a 15 mg/L, no un nutriente. Elimínelo cuando interfiera con su lectura —ensayos de fluorescencia y absorbancia en la región de 550–600 nm, citometría de flujo— y recuerde que el rojo de fenol tiene una débil actividad estrogénica, lo que importa en líneas sensibles a hormonas como MCF-7.

HEPES. Normalmente a 10–25 mM, añadido para estabilizar el pH durante la manipulación fuera del incubador. El HEPES tampona bien en torno a pH 7.2–7.4 y no depende del CO2. La contrapartida es real: el HEPES es fototóxico bajo la luz, ya que genera peróxido de hidrógeno, y a 25 mM resulta citotóxico para algunos cultivos primarios y de células madre. Úselo cuando su protocolo implique tiempos prolongados en la mesa de trabajo, no como opción por defecto.

El DMEM/F-12 es una mezcla 1:1 de DMEM y F-12 de Ham, y es lo más útil de la familia DMEM para quien avanza hacia una reducción del suero.

El F-12 de Ham, publicado por Richard Ham en 1965, se diseñó como medio químicamente definido para el crecimiento clonal y es, desde el punto de vista nutricional, lo contrario del DMEM: concentraciones moderadas de aminoácidos, pero un amplio conjunto de componentes de los que el DMEM carece —elementos traza (cinc, cobre, hierro en forma de sulfato ferroso), precursores lipídicos (ácido linoleico, ácido lipoico, putrescina), precursores de nucleósidos (hipoxantina, timidina) y vitaminas adicionales (biotina, B12)—. Mezclar ambos da una base con las concentraciones de nutrientes del DMEM y la amplitud del F-12.

La formulación estándar del DMEM/F-12 contiene 3151 mg/L de glucosa (17.5 mM), 2438 mg/L de bicarbonato de sodio (29 mM), 116.6 mg/L de cloruro de calcio, 55 mg/L de piruvato de sodio (0.5 mM), 365 mg/L de L-glutamine (2.5 mM) y 8.1 mg/L de rojo de fenol, además de los elementos traza del F-12 a la mitad de su concentración en el F-12. Una variante con HEPES muy utilizada sustituye por 15 mM de HEPES y baja el bicarbonato a unos 1200 mg/L.

El DMEM/F-12 es la base estándar para las formulaciones sin suero y con suero reducido, para el cultivo de queratinocitos y de células epiteliales, para células madre neurales (con suplemento N-2 o B-27) y para el trabajo con hibridomas e iPSC. Si está intentando reducir el suero en un proceso basado en DMEM, pasar la base a DMEM/F-12 suele ser el primer paso productivo, porque los elementos traza y los precursores lipídicos que el suero aportaba de forma discreta ya están en el medio.

El pH de trabajo del DMEM es 7.2 ± 0.2, la especificación estándar del medio y el intervalo en el que se cultiva la mayoría de las células de mamífero. Esa cifra se refiere al medio completo equilibrado en la atmósfera de CO2 prevista, que es la única condición en la que el número significa algo.

El DMEM está tamponado por el sistema bicarbonato/CO2. El CO2 disuelto forma ácido carbónico, que se disocia en bicarbonato y un protón; el pH lo fija la relación entre la concentración de bicarbonato y la presión parcial de CO2. La consecuencia es que el nivel de bicarbonato del medio y el nivel de CO2 del incubador forman una pareja que debe estar ajustada.

Por eso medir el pH de una botella recién sacada del frigorífico dice muy poco. Fuera de una atmósfera de CO2 el medio pierde CO2 disuelto y da una lectura alcalina —a menudo 7.6 o más— y vuelve a la especificación en una o dos horas dentro del incubador. Si necesita una lectura con sentido, equilibre primero una alícuota en el incubador con el tapón aflojado, o use una formulación tamponada con HEPES, cuyo pH no depende en absoluto del CO2.

Los 3700 mg/L (44 mM) de bicarbonato del DMEM se formularon para 10% CO2, no para el 5%. Este es el dato del medio que más se ignora. A 5% CO2 el bicarbonato está en exceso y el medio queda alcalino, normalmente pH 7.6–7.8 cuando se coloca recién preparado en el incubador, con un color rosa a púrpura visible. Aun así, la mayoría de los laboratorios usan DMEM a 5% CO2 y les funciona, porque las células en metabolismo producen lactato y CO2 que devuelven el pH hacia abajo en cuestión de horas. Pero un frasco recién sembrado a baja densidad no dispone de esa corrección, y la eficiencia de siembra se resiente. Si cultiva a 5% CO2 y ve el medio persistentemente púrpura, pase a 10% CO2, use una formulación con bicarbonato reducido o añada HEPES.

El problema inverso —que el medio se vuelva amarillo— es una acidificación sin más. El rojo de fenol es amarillo por debajo de aproximadamente pH 6.8. El sobrecrecimiento, una glucosa alta que impulsa la producción de lactato, un suministro de CO2 con fugas o agotado, o una contaminación bacteriana provocan todos ese efecto. Un medio amarillo en un frasco sembrado ayer y con aspecto poco poblado al microscopio apunta a contaminación más que a metabolismo.

Como el bicarbonato escapa en forma de CO2 siempre que una botella permanece abierta a presión atmosférica, el medio que se deja en la mesa de trabajo se vuelve alcalino poco a poco. Esto es normal y se revierte en el incubador. Es un motivo para mantener corto el tiempo con la botella abierta, no para desecharla.

El DMEM es la base estándar para células adherentes y dependientes de anclaje: HEK293 y sus derivados, HeLa, NIH/3T3 y otras líneas fibroblásticas, COS-7, Vero, MDCK, mioblastos C2C12, fibroblastos primarios, células de músculo liso y células endoteliales (normalmente con suplementos adicionales), y CHO adherentes. La suplementación habitual es un 10% de suero fetal bovino, o un 5–10% de suero de ternera recién nacida para las líneas más resistentes.

El calcio elevado del DMEM (1.8 mM) es un criterio de selección real, no una nota al pie. El calcio a ese nivel promueve la adhesión célula-célula mediada por cadherinas e impulsa la diferenciación de los queratinocitos; por eso los protocolos de queratinocitos y de algunas células epiteliales especifican en su lugar una base con calcio bajo. A la inversa, las células que necesitan una adhesión firme funcionan mejor en DMEM que en RPMI, cuyo calcio es de solo unos 0.4 mM.

El DMEM es una mala primera opción para los cultivos linfoides en suspensión —la mayoría de las líneas humanas de leucemia y linfoma, PBMC, hibridomas a baja densidad—, donde el medio consolidado es el RPMI 1640. Tampoco es el medio para el crecimiento clonal a muy baja densidad sin suero, para lo que se crearon el F-12 de Ham y el DMEM/F-12.

Suero. Lo estándar es un 10% de FBS. La inactivación por calor (56 °C, 30 min) es lo convencional en el trabajo sensible al complemento, pero no es necesaria de forma universal y degrada algunos factores de crecimiento; decídalo de forma deliberada y no por costumbre.

Adiciones habituales. Los aminoácidos no esenciales a 1x (a partir de una disolución madre 100x) merecen añadirse a cualquier cultivo en DMEM con suero reducido, porque el contenido propio de aminoácidos no esenciales del DMEM se limita a la glicina y la serina. Piruvato de sodio a 1 mM si no está ya presente. Penicilina/estreptomicina solo cuando sea realmente necesario: el uso rutinario de antibióticos enmascara las contaminaciones de bajo nivel y modifica el perfil de riesgo de micoplasmas.

Conservación. El DMEM líquido se conserva a 2–8 °C, protegido de la luz, y suele ser estable durante la caducidad indicada en la etiqueta (habitualmente 12–24 meses sin abrir). Una vez añadida la glutamina, considere que el medio tiene una vida útil de trabajo de unas cuatro semanas a 2–8 °C. La riboflavina, el ácido fólico, el triptófano y el HEPES son todos sensibles a la luz; dejar el medio bajo la iluminación del laboratorio genera peróxido de hidrógeno y productos de degradación que reducen la eficiencia de siembra. Guarde las botellas en oscuridad, no en una estantería abierta.

Atemperado. Atempere solo la alícuota que vaya a usar. Llevar repetidamente una botella de 500 mL a 37 °C acelera la degradación de la glutamina y la pérdida de bicarbonato. Para la mayor parte del trabajo basta con atemperar a temperatura ambiente; el medio no necesita alcanzar los 37 °C antes de ponerlo sobre las células.

El DMEM en polvo es la opción económica a gran escala, pero se envía sin bicarbonato de sodio, que debe añadirse en la reconstitución (3.7 g/L para la formulación estándar); el pH se ajusta aproximadamente 0.1–0.2 unidades por debajo del valor objetivo para compensar la subida durante la filtración, y la solución se esteriliza por filtración a través de 0.22 µm. Use agua con una resistividad de al menos 18.2 MΩ·cm y bajo contenido en endotoxinas.

Como el DMEM está tamponado con rojo de fenol y es transparente, informa de su propio estado mejor que la mayoría de los reactivos. Aprender a leerlo salva incubadores.

Contaminación bacteriana. El medio se vuelve amarillo con rapidez —a menudo de un día para otro— y se enturbia de forma visible. Al microscopio se ven partículas pequeñas, móviles o refringentes, entre las células y, a mayor densidad, una granularidad brillante. La combinación diagnóstica es amarillo más turbidez más un cultivo poco poblado o recién sembrado: el metabolismo por sí solo no puede acidificar un frasco con pocas células.

Contaminación por levaduras. Turbidez con partículas ovoides en gemación visibles, a menudo con una caída de pH más lenta que la de las bacterias. Suele aparecer como grumos discretos más que como una turbidez uniforme.

Contaminación fúngica o por mohos. Estructuras filamentosas visibles y, a veces, una colonia flotante algodonosa apreciable a simple vista. El pH puede mantenerse cerca de lo normal durante un tiempo, así que un moho puede pasar desapercibido si solo se comprueba el color.

Micoplasmas. Es la contaminación peligrosa, porque no produce turbidez, ni cambio de color, ni ningún organismo visible al microscopio óptico estándar. Los cultivos parecen normales mientras la velocidad de crecimiento disminuye, la densidad de saturación cae y los resultados experimentales se desvían. Los micoplasmas no pueden diagnosticarse inspeccionando el medio: requieren PCR, un ensayo enzimático basado en luminiscencia o tinción de ADN, y esa es la razón por la que el cribado rutinario existe en lugar de ser opcional.

Qué no es contaminación. Que el medio se vuelva púrpura tras estar en la mesa de trabajo es pérdida de bicarbonato, no una infección. Que se vuelva amarillo en un frasco confluente alimentado hace tres días es metabolismo normal. Un precipitado cristalino fino tras un ciclo de frío a calor suele ser fosfato de calcio que sale de la solución, y no crecimiento microbiano.

Cómo reducir el riesgo. Reparta el medio en alícuotas de volumen de trabajo, para que un único episodio de contaminación no cueste una botella entera. Nunca devuelva medio ya decantado a la botella de reserva. Use los antibióticos de forma deliberada: la penicilina/estreptomicina de rutina reprime las contaminaciones bacterianas de bajo nivel hasta convertirlas en un estado crónico invisible y no hace nada frente a los micoplasmas, de modo que puede ocultar el problema que parece resolver.

Usar por defecto DMEM con glucosa alta en trabajos de metabolismo. 25 mM de glucosa es una concentración farmacológica, no fisiológica, y modifica el fenotipo metabólico.

Suponer que el DMEM es un medio completo. No lo es. Sin suero o sin un suplemento diseñado a tal efecto, al DMEM le faltan lípidos, elementos traza, transferrina y factores de crecimiento.

Ignorar el desajuste entre bicarbonato y CO2. Véase más arriba; en muchos laboratorios esto cuesta eficiencia de siembra de forma silenciosa.

Usar el DMEM/F-12 y el DMEM indistintamente. Difieren en glucosa, calcio, bicarbonato, osmolalidad y contenido en elementos traza. Los datos de uno no se trasladan al otro.

Añadir glutamina a una botella y olvidar la fecha. La degradación de la glutamina produce amoníaco, que es tóxico y se acumula. Etiquete la botella en el momento de suplementarla.

Esterilizar por filtración un medio con suero a través de la membrana equivocada. La proteína se une y la obstruye; use una membrana de baja unión a proteínas y un prefiltro.

Guardar el medio en una estantería iluminada. La fotodegradación de la riboflavina y del HEPES es una fuente real y medible de citotoxicidad.