Penicilina-estreptomicina y antibiótico-antimicótico en cultivo celular

El Pen-Strep se vende como concentrado 100X, que es el único formato con el que se trabaja habitualmente. La composición estándar es fija entre proveedores:

Penicilina-estreptomicina, 100X

Antibiótico-antimicótico, 100X

Ambos se formulan normalmente en solución salina al 0.85-0.9% y se esterilizan por filtración. Para usarlos, añada 10 mL de solución 100X por litro de medio, o 5 mL por frasco de 500 mL.

Observe que la penicilina se expresa en unidades y no en masa, una convención histórica de la época en que las preparaciones de penicilina tenían una pureza variable. Para la penicilina G sódica, 1 unidad equivale aproximadamente a 0.6 ug, de modo que 100 U/mL corresponden a unos 60 ug/mL. La estreptomicina se expresa por masa. No intente convertir una en la otra ni suponga que ambos componentes están presentes con la misma potencia.

Una opción más baja. ATCC recomienda una concentración final de 50-100 IU/mL de penicilina y 50-100 ug/mL de estreptomicina allí donde se usen antibióticos. Trabajar en el extremo inferior de ese intervalo -- en la práctica, 0.5X -- reduce la carga metabólica y los efectos fuera de diana conservando la mayor parte del efecto antibacteriano, y merece considerarse en células sensibles.

La penicilina G es un betalactámico producido por hongos del género Penicillium. Se une a las proteínas fijadoras de penicilina y bloquea la etapa de entrecruzamiento del peptidoglicano catalizada por la transpeptidasa, de modo que las bacterias no pueden completar una pared celular funcional y se lisan al intentar dividirse. Como actúa sobre el ensamblaje de la pared, solo es bactericida frente a organismos en crecimiento activo. Su espectro en el contexto del cultivo celular es predominantemente grampositivo.

La estreptomicina es un aminoglucósido de Streptomyces griseus. Se une a la subunidad ribosómica 30S, provoca una lectura errónea del ARNm y bloquea el inicio de la traducción, lo que resulta bactericida. Su cobertura es predominantemente gramnegativa, con actividad útil frente a algunos grampositivos. Los espectros complementarios son justamente la razón de combinar ambas: entre las dos cubren los contaminantes bacterianos que con más frecuencia llegan a un frasco de cultivo desde la piel, el aire y el agua.

La anfotericina B, el componente antimicótico, es un macrólido poliénico de Streptomyces nodosus y suele aparecer bajo el nombre comercial Fungizone. Se une al ergosterol de las membranas fúngicas y se ensambla en poros que dejan escapar iones y moléculas pequeñas, con lo que mata levaduras y mohos.

La anfotericina B exige una precaución concreta. Su selectividad procede de su preferencia por el ergosterol frente al colesterol, pero esa preferencia es una cuestión de grado y no algo absoluto. Por encima de unos 2.5 ug/mL su toxicidad para las células de mamífero se vuelve medible, razón por la cual la concentración de trabajo se mantiene en 0.25 ug/mL -- un margen de diez veces, más estrecho de lo que la mayoría supone. Además es inestable, sensible a la luz y propensa a precipitar en la solución. Si un cultivo suplementado con anti-anti crece más despacio que las mismas células con Pen-Strep solo, la anfotericina B es lo primero que hay que sospechar.

La gentamicina, suministrada por separado, es un aminoglucósido de espectro más amplio que se emplea a 10-50 ug/mL. Es bastante más estable en el medio que la penicilina y suele preferirse para el trabajo con tejido primario y para periodos de cultivo largos en los que la actividad de la penicilina se habría degradado.

Los dos componentes del Pen-Strep no se degradan al mismo ritmo, y esto importa más de lo que suele reconocerse.

La penicilina G es químicamente frágil. El anillo betalactámico se hidroliza en solución acuosa, y el proceso se acelera a 37 °C y a pH alcalino. En medio completo a la temperatura del incubador, la penicilina pierde una fracción sustancial de su actividad en unos tres días y está prácticamente agotada hacia los cinco. Un frasco alimentado el lunes tiene el jueves una cobertura de penicilina apreciablemente menor.

La estreptomicina es bastante más estable y conserva actividad útil a lo largo de un intervalo normal entre cambios de medio.

La consecuencia práctica es que el Pen-Strep de un cultivo alimentado una vez por semana funciona, durante buena parte de esa semana, como estreptomicina sola con penicilina residual. Esto explica en parte la observación frecuente de que la contaminación por grampositivos irrumpe en cultivos nominalmente protegidos. Si la cobertura antibiótica importa de verdad en un experimento concreto, lo razonable es cambiar el medio con más frecuencia o usar un agente más estable como la gentamicina, y no subir la dosis de Pen-Strep.

Almacenamiento del concentrado. Conserve las soluciones 100X congeladas entre -5 y -20 °C, protegidas de la luz. Descongele a 2-8 °C o a temperatura ambiente, no a 37 °C, mezcle con suavidad y evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación. Reparta un frasco grande en alícuotas de un solo uso en la primera descongelación. Una vez diluido en el medio, considere que el medio tiene una vida antibiótica limitada, tal como se ha descrito.

No autoclave ni caliente estas soluciones, y no añada el concentrado a un medio que vaya a mantenerse atemperado a 37 °C durante periodos prolongados antes de su uso.

Esta es la pregunta que en realidad se hace la mayoría de quienes buscan información sobre el Pen-Strep, y merece una respuesta directa y no una descripción de producto.

El consenso entre los bancos celulares y los laboratorios de cultivo con experiencia es que el uso rutinario y continuo de antibióticos en cultivos establecidos y sanos no es una buena práctica. ATCC declara sin rodeos que no emplea antibióticos ni antimicóticos en el cultivo celular rutinario, y que su uso habitual no se recomienda salvo que sea específicamente necesario -- por ejemplo, un agente de selección como G418 que mantiene la presión sobre una línea transfectada. Esa postura no es escrupulosidad: se apoya en varios problemas concretos.

Los antibióticos enmascaran la contaminación en lugar de prevenirla. Este es el argumento central. El Pen-Strep no esteriliza un cultivo; suprime el crecimiento bacteriano por debajo del nivel en el que uno lo notaría. Un contaminante de bajo nivel que habría enturbiado el medio en dos días y se habría descubierto de inmediato puede, en cambio, persistir en silencio durante meses, alterando el pH, consumiendo nutrientes, liberando endotoxina y modificando el comportamiento de sus células, mientras el frasco parece normal. La contaminación se descubre entonces tarde, cuando ya se ha extendido a otros cultivos y ya ha influido de forma silenciosa en los resultados.

No hacen nada frente al micoplasma. El micoplasma carece de pared celular, así que la penicilina no tiene diana alguna. La estreptomicina a 100 ug/mL tampoco es fiable. El micoplasma es, con diferencia, el contaminante de cultivo de mayores consecuencias: es invisible, está presente en una fracción sustancial de los cultivos en circulación y altera el metabolismo, la velocidad de crecimiento y la expresión génica. El Pen-Strep no ofrece ninguna protección frente a él y, al suprimir la contaminación bacteriana visible que le habría llevado a descartar un frasco sospechoso, puede prolongar la vida de un cultivo positivo para micoplasma.

No son biológicamente inertes para sus células. Trabajos publicados han demostrado que los antibióticos a las concentraciones habituales de cultivo alteran la expresión génica en células de mamífero y pueden afectar a lecturas funcionales; un estudio encontró que los antibióticos inhibían la capacidad de formar esferas en cultivo en suspensión. La anfotericina B, en particular, tiene un margen estrecho entre su concentración antifúngica y la citotóxica. Si su experimento mide algo sutil, los antibióticos son una variable no controlada dentro de él.

Seleccionan resistencias. La exposición continua a dosis subletales en un entorno cálido y rico en nutrientes se acerca a las condiciones ideales para seleccionar organismos resistentes. Los laboratorios que usan antibióticos de forma continua tienden, con el tiempo, a adquirir contaminantes a los que los antibióticos ya no afectan.

Sustituyen a la técnica. El efecto más dañino es cultural, no biológico. Un laboratorio que se apoya en los antibióticos deja de detectar sus propios fallos de asepsia, porque se ha eliminado la señal de retorno: un frasco turbio al día siguiente de una sesión descuidada en la cabina.

Dónde está genuinamente justificado el uso de antibióticos:

• Aislamiento de tejido primario, donde el material de partida no es estéril y el tejido no puede simplemente reemplazarse.
• Separación celular y citometría de flujo, donde la fluídica del instrumento no es un entorno estéril.
• Material irreemplazable -- una muestra única de paciente o una línea primaria difícil -- donde perder el cultivo es peor que los inconvenientes, y por lo general durante un periodo limitado y no de forma indefinida.
• Rescate a corto plazo de una reserva valiosa, seguido de la expansión de un banco de trabajo limpio y sin antibióticos.
• Operaciones de bioproceso a gran escala en las que una evaluación de riesgos definida concluye que el balance favorece su uso.

Un compromiso viable que aplican muchos laboratorios: mantener las reservas maestras y de trabajo libres de antibióticos, de modo que cualquier contaminación se manifieste de inmediato, y añadir antibióticos solo a experimentos concretos en los que el perfil de riesgo lo justifique. Si actualmente usa Pen-Strep en todo, el experimento útil consiste en llevar una línea de buen comportamiento sin antibióticos durante unos pases y ver si ocurre algo en realidad. En un laboratorio con una técnica sólida, lo habitual es que no ocurra nada.

Añadir antibióticos o aumentar su dosis rara vez es la respuesta correcta ante una contaminación visible.

Contaminación bacteriana o fúngica en un cultivo reemplazable: deséchelo. Autoclave o descontamine de otro modo el frasco, descarte el frasco de medio y todas las alícuotas de reactivo que estuvieran abiertas al mismo tiempo, descontamine el incubador y la cabina, y reinicie a partir de un vial congelado. Intentar tratar un cultivo visiblemente contaminado suele producir un contaminante suprimido pero persistente y arriesga extenderlo por todo el incubador.

Busque el origen en lugar de tratar el síntoma. Una contaminación recurrente tiene una causa: un baño termostático, la bandeja de agua del incubador, un filtro agrietado de la cabina, una pipeta sucia, un frasco de medio compartido o un fallo concreto de técnica. Los antibióticos ocultan justamente las pruebas que necesita para encontrarla.

Analice el micoplasma de forma independiente y periódica. Las pruebas de micoplasma basadas en PCR y en luminiscencia son baratas y rápidas. Analice las líneas nuevas al recibirlas, analice antes de bancarlas y analice de forma periódica a partir de entonces. Ningún antibiótico de uso rutinario sustituye a la prueba. Existen reactivos antimicoplasma específicos que pueden limpiar un cultivo infectado, pero son una herramienta de rescate para material irreemplazable y no una estrategia de mantenimiento, y los cultivos limpiados deben volver a analizarse y volver a bancarse.

Ponga en cuarentena los cultivos entrantes. Las células que llegan de un colaborador son la vía más frecuente por la que el micoplasma entra en un laboratorio. Manipúlelas por separado hasta que se hayan analizado.

Revise los reactivos. El suero, la tripsina y el medio son fuentes potenciales. Los proveedores serios analizan la biocarga y el micoplasma, y los certificados de análisis deben revisarse en lugar de archivarse sin leer.

Adición al medio. Añada el concentrado 100X a razón de 10 mL por litro una vez preparado el medio y, si procede, filtrado. Mezcle por inversión suave. No hace falta volver a filtrar: el concentrado se suministra esterilizado por filtración.

No compense la degradación con una sobredosis. Duplicar la concentración de Pen-Strep no duplica la protección y aumenta los efectos fuera de diana sobre sus células. Si el problema es la duración de la cobertura, cambie el medio con más frecuencia o use un agente más estable.

Medios sin suero y químicamente definidos. Las células en medio sin suero suelen ser más sensibles al estrés químico que las mismas células con un 10% de suero, ya que las proteínas séricas tamponan y fijan muchos compuestos. Si utiliza antibióticos en un proceso sin suero, vigile con atención la velocidad de crecimiento y la viabilidad tras el cambio, y considere el extremo inferior del intervalo de concentración.

Los antibióticos de selección son otra cosa. La puromicina, el G418, la higromicina, la blasticidina y la zeocina se emplean para mantener la presión selectiva sobre células modificadas, no para prevenir la contaminación. Los argumentos contra el uso antibacteriano rutinario no se les aplican, aunque sí la advertencia de comprobar que su transgén se sigue expresando.

Documentación. Registre si un experimento dado se realizó con o sin antibióticos. Es una variable, sí afecta a algunas lecturas y conviene poder comprobarlo de forma retrospectiva cuando los resultados no concuerdan entre laboratorios.