El yodixanol como medio de gradiente de densidad

El yodixanol (CAS 92339-11-2, peso molecular 1550.2) es un compuesto no iónico y muy soluble en agua formado por dos anillos bencénicos triyodados unidos por un puente propílico hidroxilado, con múltiples sustituyentes dihidroxipropilo. Pertenece a la misma familia química que los agentes de contraste radiológico yodados no iónicos, de donde procede su diseño molecular: estos compuestos se concibieron para ser densos, extremadamente solubles, no iónicos y bien tolerados biológicamente, que son exactamente las propiedades que necesita un buen medio de gradiente de densidad.

Para uso de laboratorio se suministra como solución acuosa estéril al 60% (p/v) -- el formato que se vende como OptiPrep y, por otros proveedores, como solución de yodixanol al 60%. Las especificaciones clave son:

• Densidad: 1.32 g/mL a 20 C
• Osmolalidad: aproximadamente 290 mOsm/kg
• No iónico, de modo que prácticamente no aporta nada a la fuerza iónica
• Estéril y con endotoxina controlada
• Metabólicamente inerte y no tóxico para las células a las concentraciones de trabajo

La propiedad isoosmótica es la clave de todo. En un gradiente de sacarosa, alcanzar una densidad de 1.25 g/mL exige una solución con varios cientos de miliosmoles por encima de lo fisiológico, habitualmente muy por encima de 1000 mOsm/kg. Todo lo que tenga membrana y se coloque en esa solución pierde agua y se encoge, lo que cambia su densidad de flotación, distorsiona su morfología y, en el caso de células y orgánulos, los daña. El yodixanol alcanza esas mismas densidades a una osmolalidad aproximadamente fisiológica porque la molécula es grande y pesada: se obtienen muchos gramos de masa por mol de partícula disuelta. Una sola molécula de 1550 Da aporta la misma presión osmótica que una sola molécula de sacarosa de 342 Da, pero cuatro veces y media su masa.

La consecuencia práctica es que la posición de una partícula en un gradiente de yodixanol refleja su densidad de flotación hidratada real, y no una densidad adquirida por haberse deshidratado durante la centrifugación. Para el trabajo cuantitativo -- comparar cápsides de AAV llenas y vacías, caracterizar subpoblaciones de vesículas extracelulares, medir la densidad de un orgánulo -- esto no es una comodidad menor, sino la diferencia entre un resultado significativo y uno engañoso.

La disolución madre al 60% es acuosa y no contiene sales ni tampón. Usarla directamente sobre material biológico expondría la muestra a una solución sin soporte iónico, así que lo normal es convertirla primero en una disolución de trabajo, o bien diluirla directamente en el tampón elegido.

La disolución de trabajo clásica. Mezcle 5 volúmenes de yodixanol al 60% con 1 volumen de un diluyente 6x -- habitualmente NaCl al 0.85% con Tricina-NaOH 60 mM a pH 7.4, o un tampón concentrado equivalente. Así se obtiene una disolución de trabajo de yodixanol al 50% (p/v), isotónica y tamponada, con una densidad de aproximadamente 1.27 g/mL. Todas las diluciones posteriores se preparan a partir de esta disolución de trabajo usando diluyente 1x (NaCl al 0.85%, Tricina-NaOH 10 mM a pH 7.4), de modo que la fuerza iónica y el pH se mantienen constantes en todo el gradiente y solo varía la concentración de yodixanol y, por tanto, la densidad.

Este principio de tampón constante es lo que hace que los gradientes de yodixanol se comporten bien. Varíe un parámetro y mantenga fijo todo lo demás.

Dilución directa en un tampón de aplicación. En el trabajo con virus es habitual saltarse la disolución de trabajo clásica y diluir la disolución madre al 60% directamente en el tampón que use el proceso, casi siempre PBS-MK (solución salina tamponada con fosfato con MgCl2 1 mM y KCl 2.5 mM). Es lo que hace el protocolo estándar de AAV.

Cálculo de una dilución. Para preparar un volumen V de una solución a una concentración C% a partir de la disolución madre al 60%:

Volumen de disolución madre al 60% = V x C / 60 Volumen de diluyente = V - (V x C / 60)

Por ejemplo, 10 mL de yodixanol al 40% requieren 10 x 40/60 = 6.7 mL de disolución madre al 60% y 3.3 mL de diluyente.

Manipulación práctica. La solución al 60% es notablemente viscosa, así que pipetee despacio y deje que las puntas escurran por completo: pipetear con descuido es una fuente real de error en la composición del gradiente. Atempérela antes de usarla, ya que la viscosidad cae bruscamente con la temperatura. Consérvela a temperatura ambiente protegida de la luz; no la congele. Las soluciones de yodixanol son estables durante periodos largos, pero deben mantenerse estériles si el producto final debe serlo.

Añadir rojo de fenol como marcador visual a escalones alternos es un pequeño truco que se amortiza solo. En el gradiente estándar de AAV, el rojo de fenol se añade a las capas del 25% y del 60%, de modo que el gradiente terminado muestra bandas coloreadas e incoloras visibles, las interfases resultan evidentes y se ve de inmediato si la superposición de capas fue limpia y si el gradiente se alteró al trasladarlo al rotor.

El gradiente de yodixanol de cuatro escalones que introdujeron Zolotukhin y colaboradores en 1999 sigue siendo el método de laboratorio estándar para purificar AAV recombinante a partir de lisado celular crudo, y es la razón más frecuente por la que se busca información sobre el yodixanol.

Por qué funciona. Las cápsides de AAV que contienen un genoma empaquetado son más densas que las cápsides vacías, porque el ADN es denso. Un gradiente ajustado a esa diferencia separa las partículas llenas de las vacías y, al mismo tiempo, deja atrás la mayor parte de la proteína y el ácido nucleico celulares.

Composición del gradiente. Se superpone en un tubo de ultracentrífuga sellable, primero el más denso, de modo que la muestra quede encima:

El NaCl 1 M del escalón del 15% no es accesorio: hace un trabajo concreto, que es arrancar de la superficie de la cápside la proteína y el ácido nucleico del huésped unidos electrostáticamente a medida que el virus la atraviesa. Omitirlo reduce la pureza de forma apreciable.

Centrifugación. En un rotor de ángulo fijo como el Type 70 Ti, 350000 x g durante 90 minutos a 10 C es una condición estándar; 200000 x g durante 2 horas a 18 C es una alternativa equivalente. Se usan tubos sellados de tipo QuickSeal porque los tubos deben quedar completamente llenos.

Recogida. Recoja de la capa del 40%, extrayendo justo por debajo de la interfase 40-60%. Las cápsides llenas se concentran en la parte inferior del escalón del 40%. Perfore la pared lateral del tubo con una aguja justo por debajo de la interfase y extraiga despacio, tomando la capa del 40% y evitando la interfase 25-40% superior, donde se acumulan las cápsides vacías y la proteína residual. Recoger demasiado alto es la forma más habitual de arrastrar cápsides vacías al producto final.

Qué cabe esperar. Las preparaciones purificadas con yodixanol suelen contener todavía alrededor de un 20% de partículas vacías de media. El gradiente es un paso de enriquecimiento potente, no una separación absoluta. Cuando se exige una proporción de vacías muy baja, al yodixanol le sigue normalmente un paso ortogonal, como la cromatografía de intercambio aniónico, o se sustituye por un bandeado en cloruro de cesio de calidad analítica, a costa del rendimiento por lote y de la integridad de la cápside, respectivamente.

Eliminación del yodixanol. El yodixanol debe eliminarse antes de la mayoría de las aplicaciones posteriores, en particular cualquier trabajo in vivo o cualquier ensayo sensible a la viscosidad o al índice de refracción. Sirven el intercambio de tampón por diálisis, columna de desalado, concentrador centrífugo o filtración de flujo tangencial. No dé por hecho que basta con diluir: el yodixanol residual interfiere en la cuantificación de proteína y en algunos métodos de titulación.

Separación de células. El yodixanol permite separaciones celulares tanto por barrera de densidad como por gradiente continuo a osmolalidad fisiológica, que es su principal ventaja sobre los medios de polisacarosa-diatrizoato empleados tradicionalmente para ese fin. Las separaciones de células sanguíneas se apoyan en puntos de corte de densidad bien establecidos: las células mononucleares se recuperan por convención por encima de una barrera de 1.077 g/mL, mientras que los granulocitos y los eritrocitos la atraviesan y sedimentan. El yodixanol puede ajustarse a cualquier densidad necesaria con una simple dilución y, por ser isoosmótico, las células no se deshidratan durante la separación, así que su densidad durante la centrifugación es su densidad real.

Con células, deposite la muestra suavemente sobre la barrera, use un rotor de cubetas basculantes y centrifugue con el freno desactivado o al mínimo para que la interfase no se altere durante la desaceleración. Recupere de la interfase, diluya en tampón y lave para eliminar el medio del gradiente.

Fraccionamiento subcelular. El yodixanol separa fracciones de mitocondrias, lisosomas, peroxisomas, retículo endoplásmico, Golgi y membrana plasmática, y resulta especialmente valioso para orgánulos con densidades próximas entre sí, ya que los gradientes de sacarosa los distorsionan de forma desigual por deshidratación osmótica. Se emplean tanto gradientes escalonados o continuos preformados como gradientes autogenerados: el yodixanol forma un gradiente in situ cuando se centrifuga una solución uniforme a alta velocidad en un rotor vertical o casi vertical, lo que elimina el paso manual de superposición de capas y mejora la reproducibilidad entre centrifugaciones.

Vesículas extracelulares. La flotación en gradiente de densidad se ha convertido en el método de referencia para separar las vesículas extracelulares de los agregados proteicos y las lipoproteínas que coaislan con ellas y que los métodos basados en sedimentar por ultracentrifugación no pueden distinguir. Un enfoque típico carga la preparación cruda de vesículas en el fondo del tubo, en una capa densa de yodixanol, y deja que las vesículas floten hacia arriba hacia un gradiente de escalones de menor densidad -- por ejemplo 40%, 20%, 10% y 5% -- durante una centrifugación larga. Hacerlas flotar en lugar de sedimentarlas es deliberado: los agregados proteicos son densos y se quedan atrás, mientras que las vesículas delimitadas por membrana ascienden hasta su densidad de flotación. Las vesículas extracelulares pequeñas suelen bandear en la región de 1.08-1.19 g/mL, aunque la cifra exacta depende del material de partida y debe determinarse para su sistema midiendo el índice de refracción de las fracciones recogidas, en lugar de darla por supuesta.

Otros virus. Los mismos principios usados para el AAV se aplican al lentivirus, el adenovirus, el virus de la gripe y muchos otros, ajustando los porcentajes de los escalones para acotar la densidad de flotación de la partícula en cuestión. El yodixanol suele ser más benévolo con los virus envueltos que la sacarosa o el cloruro de cesio, que pueden arrancar la envoltura y reducir el título infeccioso.

Use yodixanol cuando necesite osmolalidad fisiológica, trabaje con células intactas, orgánulos, virus envueltos o vesículas, quiera densidades de flotación que signifiquen algo, o necesite un medio que pueda eliminarse por un simple intercambio de tampón sin diálisis frente a grandes volúmenes.

La sacarosa es barata, familiar y del todo adecuada para material robusto y no sensible a la osmolaridad. Su problema es osmótico: las soluciones de sacarosa de alta densidad son marcadamente hipertónicas, deshidratan cualquier cosa con membrana, desplazan las densidades aparentes y dañan los virus envueltos y los orgánulos. Además es viscosa a concentraciones altas, lo que alarga las centrifugaciones.

El cloruro de cesio alcanza densidades muy superiores a las de cualquier medio no iónico, hasta alrededor de 1.9 g/mL, y ofrece una resolución excelente para ácidos nucleicos y para separar cápsides de AAV llenas de vacías. Los costes son sustanciales: fuerza iónica muy alta, tiempos de centrifugación prolongados, diálisis obligatoria para eliminar la sal y una pérdida documentada de infectividad del AAV frente al yodixanol, que es justamente el motivo por el que el campo se pasó al yodixanol para el trabajo preparativo conservando el CsCl para las aplicaciones analíticas.

El Percoll es una suspensión de sílice coloidal recubierta de polivinilpirrolidona. Es isoosmótico cuando se ajusta con sales y resulta excelente para separaciones de células y orgánulos, pero su densidad máxima de trabajo se limita a unos 1.13 g/mL, lo que deja fuera de alcance a la mayoría de los virus. Como es un coloide en partículas y no una verdadera solución, debe eliminarse del producto, y no es adecuado cuando la preparación vaya a pasar a un método analítico sensible a partículas.

Los medios de polisacarosa-diatrizoato sódico (la familia Ficoll-Paque) son la opción tradicional para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica con una barrera de 1.077 g/mL. Están bien validados para esa tarea concreta y se siguen usando mucho para ella, pero son menos flexibles que el yodixanol para construir densidades arbitrarias y no son isoosmóticos en todo su intervalo.

El Nycodenz, el monómero yodado no iónico que precedió al yodixanol, alcanza densidades altas pero se vuelve hiperosmótico por encima de aproximadamente 1.15 g/mL. El yodixanol se desarrolló como dímero precisamente para corregir esa limitación, y por eso desplazó al Nycodenz en la mayoría de las aplicaciones de alta densidad.

Superponga las capas con cuidado, de abajo arriba o de arriba abajo, pero de forma coherente. O bien introduzca las soluciones más densas por debajo de las más ligeras con una cánula larga, o bien deposite con suavidad las soluciones más ligeras sobre las más densas deslizándolas por la pared del tubo. Mezclar ambos métodos en un mismo gradiente produce interfases alteradas. Use rojo de fenol en escalones alternos para poder ver lo que ha construido.

Llene por completo los tubos sellados. Los tubos de ultracentrífuga para rotores de ángulo fijo a estas velocidades deben ir llenos o colapsarán. Consulte el llenado mínimo en el manual del rotor.

Equilibre dentro de la tolerancia del rotor. A 350000 x g, un desequilibrio no es un asunto menor.

Deje que los gradientes se relajen, pero no demasiado. Los gradientes escalonados preformados pueden dejarse reposar brevemente para suavizar las interfases marcadas, pero un gradiente abandonado durante horas se difundirá hasta convertirse en algo que usted no diseñó.

Desaceleración. Use el freno desactivado, o el ajuste más bajo, siempre que una interfase deba sobrevivir a la parada. Esto vale sobre todo para las separaciones de células.

Mida las fracciones en lugar de fiarse del plano. Si un resultado importa, recoja fracciones y mida el índice de refracción de cada una para establecer el perfil de densidad real, y relacione después la posición de su material con un número real. Los gradientes no siempre se forman exactamente como estaba previsto, y medir el índice de refracción lleva minutos.

Problemas frecuentes:

• El material aparece repartido en muchas fracciones en lugar de bandeado. Suele deberse a un tiempo de centrifugación insuficiente, o a un gradiente cuyo intervalo de densidad es demasiado amplio. Estreche el intervalo en torno a la densidad esperada y alargue la centrifugación.
• No bandea nada donde se esperaba. Confirme el gradiente real por índice de refracción antes de ajustar cualquier otra cosa. Compruebe también que la muestra se cargó en la posición correcta: los enfoques de flotación y de sedimentación cargan en extremos opuestos.
• Pureza pobre del AAV. Compruebe que el escalón del 15% contenía NaCl 1 M, y compruebe desde dónde extrajo la recogida: tomar material demasiado alto en la capa del 40% arrastra cápsides vacías.
• Recuperación baja. El yodixanol es viscoso; una recogida lenta y cuidadosa importa. Confirme también que el material no permaneció en el medio del gradiente durante un periodo prolongado antes del intercambio de tampón.
• Los ensayos posteriores se comportan de forma anómala. El yodixanol residual interfiere en la cuantificación de proteína y en los métodos basados en el índice de refracción. Complete el intercambio de tampón antes de ensayar.