Células Sf9 y el sistema de expresión con baculovirus

Sf9 es un aislado clonal derivado de la línea parental IPLB-Sf21-AE (Sf21), que se estableció a partir de tejido ovárico pupal de Spodoptera frugiperda, el gusano cogollero. Sf9 se seleccionó de esa población por su crecimiento más rápido y su mayor susceptibilidad a la infección por baculovirus, y está depositada como ATCC CRL-1711.

Morfológicamente son células redondas, semiadherentes y de aproximadamente 15-17 um de diámetro cuando están sanas. Se adhieren de forma lo bastante laxa como para desprenderlas golpeando suavemente el frasco en lugar de recurrir a la tripsinización, lo que constituye una de las comodidades prácticas de trabajar con ellas, y se adaptan sin dificultad al cultivo en suspensión completa.

Sf9 existe para servir al sistema de vectores de expresión de baculovirus (BEVS). El vector es el nucleopoliedrovirus múltiple de Autographa californica (AcMNPV), un virus de insecto grande con ADN de doble cadena. En la naturaleza, el virus dedica la fase final de la infección a producir cantidades enormes de dos proteínas, la poliedrina y la p10, bajo promotores muy tardíos excepcionalmente potentes. Los sistemas recombinantes sustituyen la secuencia codificante y conservan el promotor, de modo que la capacidad de traducción de la célula se redirige hacia la proteína de interés. Son habituales rendimientos de decenas a cientos de miligramos por litro.

El sistema resulta atractivo porque las células de insecto son eucariotas: forman puentes disulfuro, realizan procesamiento proteolítico y muchas modificaciones postraduccionales que los sistemas bacterianos no pueden llevar a cabo. Además, es seguro trabajar con ellas, ya que los baculovirus no se replican en células de mamífero, y los cultivos crecen en condiciones próximas a la temperatura ambiente y sin control de CO2.

Más allá de la producción de proteínas de investigación, las Sf9 y otras líneas celulares de insecto relacionadas se emplean a escala de fabricación, incluidos productos autorizados de vacunas y de terapia génica, y por eso los medios sin suero y libres de origen animal para estas células ocupan una parte significativa del mercado de medios de bioproceso.

El cultivo de células de insecto difiere del de células de mamífero en varios aspectos que sorprenden en el primer contacto.

Temperatura: 27 C. Las células Sf9 se cultivan a 27-28 C, no a 37 C. Basta con un incubador estándar sin humidificación o incluso una sala con temperatura controlada. El crecimiento se ralentiza de forma acusada por debajo de 25 C y las células sufren estrés por encima de 30 C.

Sin CO2 y sin necesidad de humidificación. Los medios para insecto se tamponan con fosfato y no con bicarbonato, de modo que no necesitan atmósfera de CO2 para mantener el pH. Meter células Sf9 en un incubador al 5% de CO2 acidificará el medio. La humidificación es innecesaria para los cultivos en suspensión en recipientes cerrados, aunque reduce la evaporación en cultivos adherentes prolongados.

pH 6.2-6.4. Los medios para insecto trabajan alrededor de una unidad de pH completa por debajo de los medios de mamífero. Esto es normal y correcto; no intente ajustarlo hacia 7.2.

Osmolalidad más alta. Los medios para insecto están formulados a una osmolalidad mayor que los de mamífero, normalmente en la franja de 340-380 mOsm/kg. Esto importa al preparar adiciones: diluir un cultivo de insecto con un tampón de mamífero como el PBS provoca un choque osmótico.

Cultivo en suspensión.

• Agite a 100-130 rpm en un matraz de agitación; en torno a 110 rpm es una cifra de trabajo habitual. Una agitación adecuada es imprescindible porque estas células son densas y sedimentan rápido, y porque la transferencia de oxígeno limita el crecimiento a densidad alta.
• Mantenga el volumen de cultivo igual o inferior a una quinta parte del volumen nominal del matraz. Un matraz de 250 mL no debería contener más de 50 mL. Sobrellenarlo priva de oxígeno al cultivo y es una de las causas más frecuentes de crecimiento deficiente.
• Se requieren tapones con filtro o tapones aflojados para permitir el intercambio de gases.

Subcultivo.

• Subcultive cuando el cultivo alcance aproximadamente 2.5-3.5 x 10^6 células/mL y diluya hasta cerca de 1 x 10^6 células viables/mL. Sf21, en cambio, se subcultiva normalmente a 1.5-2 x 10^6 y se diluye hasta 0.5 x 10^6.
• No deje que los cultivos se sobrecrezcan. Las células que superan la densidad máxima pierden infectabilidad y tardan varios pases en recuperarse; esta es una causa oculta frecuente de expresión deficiente.
• El tiempo de duplicación es de 18-24 horas en un cultivo sano, con 18-22 horas como valor típico. Un tiempo de duplicación que se desplaza por encima de 24 horas es un aviso temprano y fiable de un problema con el medio, la temperatura, la oxigenación o las propias células.
• Mantenga la viabilidad por encima del 95% en las células destinadas a transfección o a producción de proteína.

Número de pase. Las líneas de insecto derivan con el subcultivo prolongado y pierden productividad y a veces infectabilidad. Fije un límite de pases documentado, vuelva a un vial congelado en lugar de arrastrar un cultivo indefinidamente y valide la expresión periódicamente. Hay trabajos publicados con estas líneas realizados dentro de límites tan bajos como 15 pases; muchos laboratorios trabajan hasta 20-30. Sea cual sea el límite que fije, déjelo registrado.

La formulación histórica. El medio para insectos de Grace, suplementado con suero fetal bovino más autolizado de levadura e hidrolizado de lactoalbúmina, es la base clásica; la versión suplementada se conoce ampliamente como TNM-FH, normalmente con un 10% de FBS inactivado por calor. Funciona, y buena parte de la bibliografía fundacional sobre baculovirus se generó con él.

La práctica moderna es sin suero. Las células Sf9 se adaptan al cultivo en suspensión sin suero con más facilidad que la mayoría de las líneas de mamífero, y los medios comerciales sin suero para insecto sostienen de forma rutinaria un crecimiento y una expresión iguales o mejores que las formulaciones con suero. Hay pocas razones para mantener el suero en un proceso rutinario con Sf9, y varias para no hacerlo:

• La purificación posterior es mucho más sencilla. El suero aporta un fondo proteico grande y variable que hay que separar de un producto secretado.
• La variabilidad entre lotes desaparece como fuente de fluctuaciones inexplicadas del rendimiento.
• Consideraciones regulatorias y de suministro. Los medios libres de origen animal eliminan una materia prima de origen bovino de un proceso de fabricación, lo que simplifica tanto la evaluación de riesgos como la documentación.
• El coste a escala favorece la opción sin suero, y los formatos en polvo seco reducen aún más la carga de transporte y almacenamiento.

Qué buscar en un medio sin suero para insecto: que sostenga tanto la fase de crecimiento como la de infección sin cambio de medio, una composición definida o libre de origen animal, y un rendimiento constante entre lotes. Algunos procesos se benefician de una alimentación o suplemento independiente añadido en el momento de la infección o poco después, ya que la fase muy tardía de la expresión con baculovirus es metabólicamente exigente y el agotamiento de nutrientes en ese punto limita directamente el rendimiento.

Adaptación al cultivo sin suero. La adaptación suele ser gradual: reduzca el suero por etapas a lo largo de varios pases —por ejemplo 10%, 5%, 2.5%, 1%, 0%—, dejando que el cultivo recupere su velocidad de crecimiento normal y una viabilidad superior al 95% antes de cada nueva reducción. La adaptación directa funciona a veces, pero arriesga la pérdida del cultivo. Congele un banco de células al final de la adaptación antes de hacer cualquier otra cosa con ellas.

Polvo frente a líquido. Los medios en polvo seco se preparan en el propio laboratorio y son bastante más baratos por litro a escala, a cambio de exigir control de la calidad del agua, ajuste de pH y capacidad de filtración. Para procesos por encima de unas pocas decenas de litros, ese cambio suele merecer la pena.

La multiplicidad de infección (MOI) es la relación entre partículas víricas infecciosas y células, y el valor correcto depende por completo de lo que se pretenda hacer:

• Amplificar un lote de virus: MOI 0.01-0.1. Una MOI baja deja al principio la mayoría de las células sin infectar, de modo que el virus atraviesa varias rondas de replicación y se amplifica de forma sustancial. La amplificación a MOI alta es contraproducente y acelera la acumulación de partículas defectuosas.
• Producir proteína: MOI 2-10. Una MOI alta infecta prácticamente todas las células a la vez, lo que da una infección sincrónica y una ventana de producción bien definida. Algunos procesos usan deliberadamente una MOI menor con un tiempo de recolección más largo para ahorrar lote de virus.

Infecte células en fase exponencial. Infecte a aproximadamente 1-2 x 10^6 células/mL en suspensión, con una viabilidad superior al 95% y con el cultivo en crecimiento activo, no acercándose a la fase estacionaria. Infectar un cultivo sobrecrecido es una de las causas más frecuentes de rendimientos decepcionantes.

Título vírico. Los lotes amplificados alcanzan normalmente de 0.5 x 10^8 a 5 x 10^8 PFU/mL. Titúlelos mediante ensayo de placa o por un método de punto final equivalente. Un lote sin titular vuelve carente de sentido la MOI e imposibilita el diagnóstico de una expresión fallida.

Conservación de los lotes de virus. Guarde los lotes de trabajo a 4 C, protegidos de la luz, donde son utilizables durante unos 4-6 meses, y los lotes de archivo a -80 C durante años. El baculovirus pierde título de forma continua a 4 C, así que vuelva a titular los lotes conservados mucho tiempo. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación de los lotes congelados.

Efecto de pase. Pasar en serie un baculovirus a MOI alta genera partículas interferentes defectuosas que reducen la expresión: el bien documentado efecto de pase. Amplifique siempre a partir de un lote maestro de pase bajo y a MOI baja, en lugar de pasar en serie un lote de trabajo.

Recolección.

• Incube 3-5 días después de la infección a 27 C.
• Vigile a diario. Las células infectadas se agrandan de forma apreciable, el crecimiento se detiene, aumenta la granularidad y cae la viabilidad.
• Una regla práctica de recolección es detenerse cuando la viabilidad llega al 60-70%. Recolectar antes cuesta rendimiento; recolectar después expone el producto a las proteasas liberadas y a una cantidad creciente de restos celulares.
• Los productos secretados se recuperan del sobrenadante clarificado; los productos intracelulares requieren lisis celular. Clarifique por centrifugación, por ejemplo 10 minutos a 4 C.
• Optimice empíricamente el momento de la recolección para cada construcción tomando muestras diarias en un ensayo piloto pequeño. El momento óptimo para una proteína secretada estable suele ser más tardío que para una proteína intracelular lábil.

Tres líneas de insecto dominan el trabajo práctico, y no son intercambiables.

Sf9 es la opción de uso general por defecto. Crece rápido, se adapta bien a la suspensión sin suero, tolera un amplio abanico de condiciones y da lotes de virus fiables y reproducibles. Es el hospedador estándar para la amplificación de virus y la titulación por ensayo de placa, y un hospedador perfectamente válido para la producción de proteína.

Sf21 es la línea parental. Es algo más grande, crece un poco más despacio y suele describirse como más indulgente ante una manipulación subóptima. Algunas construcciones se expresan mejor en Sf21 que en Sf9, y sigue siendo la preferida para ciertos ensayos de placa por su comportamiento en monocapa. Tenga en cuenta las distintas densidades de referencia indicadas antes.

High Five (BTI-Tn-5B1-4), procedente de Trichoplusia ni, da con frecuencia rendimientos mayores de proteínas secretadas que Sf9, en ocasiones bastante mayores. Las contrapartidas son que es menos robusta en suspensión, más sensible a las condiciones de cultivo y por lo general no se usa para amplificar virus. Un flujo de trabajo muy habitual consiste en amplificar el virus en Sf9 y expresar la proteína en High Five, probando ambos hospedadores con cada construcción nueva.

La glucosilación es la limitación importante que comparten. Las células de insecto no realizan la N-glucosilación compleja de tipo mamífero. Producen estructuras cortas de tipo paucimanosa (normalmente Man3GlcNAc2, a menudo con fucosilación del núcleo) en lugar de los glucanos complejos, galactosilados y sialilados de las células de mamífero, y no añaden ácido siálico terminal. Para la biología estructural, la enzimología y muchos antígenos vacunales esto es irrelevante o incluso ventajoso, ya que los glucanos pequeños y homogéneos facilitan la cristalización. Para una glucoproteína terapéutica en la que la estructura del glucano determina la semivida o la función efectora, resulta descalificante, y el hospedador adecuado es CHO o HEK293. Existen líneas de insecto modificadas por ingeniería glucídica que añaden procesamiento de tipo mamífero, pero son herramientas especializadas y no hospedadores rutinarios.

Agentes adventicios. Se ha comprobado que las células Sf9 pueden portar virus latentes de insecto, entre ellos un rabdovirus identificado en lotes de Sf9 ampliamente distribuidos. Estos no se replican en células de mamífero y no suponen un problema de bioseguridad en el laboratorio, pero sí son una consideración relevante en fabricación, donde se emplean bancos celulares cualificados y libres de virus y los análisis forman parte de la estrategia de liberación. Para el trabajo de investigación, la implicación práctica es simplemente obtener las células de un banco acreditado con procedencia documentada, y no de una cesión entre laboratorios sin documentación.

Crecimiento lento o tiempo de duplicación superior a 24 horas. Compruebe primero la temperatura y después la oxigenación: un volumen de llenado del matraz superior a la quinta parte y una agitación por debajo de unas 100 rpm son los culpables habituales. Revise a continuación la antigüedad y el lote del medio, y si el cultivo se sobrecreció en un pase reciente. Verifique que el incubador no esté programado para suministrar CO2.

Viabilidad baja tras el pase. Suele deberse a daño mecánico por pipeteo o raspado demasiado enérgicos, o a un choque osmótico por diluir con un tampón inadecuado. Las células Sf9 se desprenden con golpes suaves, no por la fuerza.

Agregación celular. Es frecuente a densidad alta y en algunas formulaciones sin suero. Subcultive a menor densidad, asegure una agitación adecuada y compruebe que el cultivo no esté sobrecrecido.

Rendimiento bajo de proteína con un buen lote de virus. Fíjese en el estado de las células en el momento de la infección antes que en el virus. Infectar un cultivo pasada la fase exponencial, a una densidad demasiado baja o con menos del 95% de viabilidad reduce sustancialmente el rendimiento. Compruebe después el momento de recolección tomando una serie de muestras diarias.

Rendimiento decreciente en producciones sucesivas. Sospeche del efecto de pase en el lote de virus, o de una deriva de la línea celular por un número de pases elevado. Vuelva a un vial celular congelado y reamplifique el virus a partir de un lote maestro de pase bajo y a MOI baja.

Ausencia total de expresión. Confirme que el lote de virus tiene un título real mediante ensayo de placa, y confirme la construcción secuenciando a través del punto de inserción. Un lote sin titular y una construcción sin verificar explican, entre ambos, la mayoría de los fracasos totales.

Criopreservación. Congele las Sf9 a alta densidad en una mezcla de medio fresco y medio condicionado con DMSO como crioprotector, aplicando un enfriamiento a velocidad controlada. Las células de insecto se recuperan bien, pero deben devolverse a la suspensión con suavidad y dejar que transcurran varios pases hasta alcanzar el tiempo de duplicación normal antes de usarlas en una tanda de producción.