Tampón HEPES en el cultivo celular

El HEPES es el ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico, CAS 7365-45-9, con una masa molecular de 238,30 g/mol en su forma de ácido libre. Pertenece a la familia de tampones zwitteriónicos descrita por Norman Good y sus colaboradores en la década de 1960, seleccionados específicamente para el trabajo biológico conforme a una lista de criterios: un pKa dentro del intervalo fisiológico, elevada solubilidad en agua, permeabilidad mínima a través de las membranas celulares, baja absorbancia en el visible y el ultravioleta cercano, estabilidad química y escasa tendencia a formar complejos con iones metálicos.

Esos criterios de diseño son la razón por la que se prefiere el HEPES a tampones orgánicos más antiguos. Un tampón que atravesara libremente la membrana plasmática tamponaría tanto el citoplasma como el medio y alteraría el pH intracelular. Un tampón que quelara calcio, magnesio, cinc o hierro retiraría metales traza de la formulación y modificaría el comportamiento celular de un modo que puede confundirse con un resultado biológico. El HEPES evita ambos problemas razonablemente bien, y por eso se ha convertido en el tampón suplementario por defecto en el cultivo de células de mamífero.

El HEPES se comercializa en dos formas químicamente distintas, y la diferencia importa al preparar las disoluciones madre. El ácido libre (masa molecular 238,30) se disuelve dando una disolución fuertemente ácida y debe valorarse al alza con hidróxido de sodio para alcanzar un pH de trabajo. La sal sódica (HEPES-Na, masa molecular 260,29) se disuelve dando una disolución básica y se valora a la baja con ácido clorhídrico. Las disoluciones 1 M ya preparadas que se suministran para cultivo celular vienen valoradas dentro de la ventana de pH 7,0-7,6 y esterilizadas por filtración, lo que elimina el paso de valoración y la incertidumbre asociada al aporte de sodio.

Un punto que se malinterpreta con frecuencia: el HEPES es un tampón, no un nutriente. No aporta nada al metabolismo celular. El bicarbonato, en cambio, es a la vez tampón y sustrato metabólico, ya que alimenta reacciones de carboxilación que las células realmente necesitan. Por eso el HEPES complementa un sistema de bicarbonato en lugar de sustituirlo.

El HEPES tiene un pKa de aproximadamente 7,48 a 25 °C y tampona eficazmente en un intervalo de pH de aproximadamente 6,8 a 8,2. Un tampón funciona mejor dentro de una unidad de pH a cada lado de su pKa, y el pH fisiológico de cultivo, de 7,2-7,4, coincide casi exactamente con el pKa del HEPES. Esa es toda la razón de su uso: el tampón trabaja en su punto de máxima capacidad justo donde las células lo necesitan.

La complicación práctica es que el pKa del HEPES depende de la temperatura y se desplaza hacia abajo unas 0,014 unidades de pH por cada grado Celsius de calentamiento. La consecuencia es concreta y sorprende a mucha gente con regularidad. Una disolución de HEPES valorada a pH 7,4 en la mesa de trabajo a 22 °C marcará un valor más próximo a pH 7,2 una vez equilibrada a 37 °C en el incubador. Si su experimento depende de un pH definido a la temperatura de trabajo, valore la disolución madre a 37 °C o bien valórela a temperatura ambiente hasta un valor de consigna deliberadamente más alto y compruebe el valor a 37 °C antes de usarla.

Las cifras de pKa que aparecen en la documentación de los proveedores varían ligeramente (circulan valores de 7,31 a 37 °C, 7,48 a 25 °C y 7,55 a 20 °C) porque se comunican a distintas temperaturas y fuerzas iónicas. No se contradicen: describen la misma curva de temperatura muestreada en puntos diferentes. Lo que importa en la práctica es la dirección y el orden de magnitud del desplazamiento, no el tercer decimal.

La fuerza iónica también modifica algo el pKa efectivo. En un medio completo a fuerza iónica fisiológica, el comportamiento tamponante se aproxima lo suficiente al valor tabulado como para que rara vez merezca la pena corregirlo, pero es otra razón para comprobar el pH en la formulación final en lugar de fiarse de la disolución madre.

El intervalo de trabajo en cultivo de células de mamífero es de 10-25 mM, siendo 25 mM la elección única más habitual y 10-15 mM la preferida para células primarias sensibles y cultivos prolongados. Por encima de unos 25 mM el beneficio se estanca y empiezan a predominar los riesgos que se comentan más abajo; concentraciones de 50 mM o superiores son citotóxicas para muchas líneas y no se utilizan en cultivo de rutina.

Las diluciones a partir de una disolución madre 1 M son sencillas:

Hay dos aspectos que conviene tener en cuenta cuando se añade HEPES a un medio ya completo, en lugar de comprar una formulación que lo incluya.

La osmolalidad sube. Una disolución de HEPES 1 M está mucho más concentrada que el medio al que se incorpora, y su adición eleva la osmolalidad total. El medio para células de mamífero se sitúa normalmente en torno a 260-320 mOsmol/kg, y añadir HEPES en el extremo alto del intervalo de trabajo puede llevar más allá del límite superior a una formulación que ya estaba cerca de él. Los medios que se venden «con HEPES» llevan reducido el cloruro de sodio para compensarlo; el medio que usted suplementa por su cuenta, no. Si trabaja con células osmóticamente sensibles, mídala.

El aporte de sodio sube. Valorar el ácido libre HEPES hasta pH 7,4 requiere aproximadamente un equivalente de hidróxido de sodio, de modo que una adición de HEPES 25 mM incorpora una cantidad comparable de sodio adicional. En cultivo de rutina esto es insignificante. En electrofisiología o en trabajos con control cuidadoso de la osmolalidad, no lo es.

No retire el bicarbonato de sodio de una formulación al añadir HEPES. La configuración estándar es bicarbonato a la concentración ajustada a su incubador más HEPES por encima, y ambos cumplen una función útil.

El tampón por defecto en casi todos los medios clásicos es el bicarbonato de sodio actuando con el CO2 de la atmósfera del incubador. El CO2 disuelto se hidrata a ácido carbónico, que se disocia en bicarbonato y un protón. El pH al que se estabiliza el medio viene fijado por la relación entre la concentración de bicarbonato del medio y la de CO2 disuelto, y por eso el contenido de bicarbonato de una formulación debe ajustarse al ajuste de gas del incubador. El DMEM con 3,7 g/L de bicarbonato de sodio está diseñado para una atmósfera con 10% de CO2; las formulaciones con 1,5-2,2 g/L están diseñadas para 5% de CO2. Usar una formulación de 3,7 g/L al 5% de CO2 deja el medio persistentemente alcalino.

La debilidad del sistema del bicarbonato es que la mitad de él es un gas. Saque el frasco del incubador y el CO2 pasará del medio al aire ambiente, que contiene alrededor de un 0,04% de CO2. El bicarbonato se queda, la relación se desplaza y el pH sube. Bajo una cabina de flujo laminar, un medio tamponado solo con bicarbonato puede derivar visiblemente hacia la alcalinidad en diez o veinte minutos; con rojo de fenol presente, puede verse cómo el medio pasa del rojo hacia el púrpura.

El HEPES no tiene ningún componente volátil. Su capacidad tamponante queda fijada por la cantidad añadida y no depende de lo que haga la atmósfera. Esa es la única propiedad que lo hace valioso, y explica todas las situaciones en las que merece la pena usarlo.

La contrapartida es que el HEPES no aporta el ion bicarbonato, que las células consumen en las reacciones de carboxilación, y no reproduce la química tamponante fisiológica. Eliminar por completo el bicarbonato en favor del HEPES enlentecerá o detendrá el crecimiento en muchas líneas. La configuración correcta en casi todos los casos es usar ambos.

El HEPES se gana su sitio siempre que las células vayan a pasar un tiempo apreciable fuera de una atmósfera de CO2 controlada:

• Microscopía de células vivas en una platina sin control de gases. Una serie de time-lapse de una hora o más en aire ambiente es el caso clásico. Con 20-25 mM de HEPES el pH se mantiene durante todo el registro.
• Citometría de flujo y separación celular. Las separaciones son largas, las muestras permanecen en tubos con el CO2 ambiental y la deriva del pH deteriora la viabilidad antes de terminar la sesión.
• Disociación de tejido primario. Las digestiones se realizan en la mesa de trabajo, al aire, a menudo durante 30 minutos o varias horas. Existen medios de disociación y de mantenimiento tamponados con HEPES precisamente para esto.
• Transporte de cultivos vivos. Los frascos que se trasladan entre edificios o se envían con entrega al día siguiente no disponen de aporte de CO2. HEPES más un frasco lleno (no gaseado) es el procedimiento estándar.
• Manipulación frecuente o prolongada. Los protocolos con muchos pasos de manipulación en la cabina acumulan deriva alcalina; el HEPES la atenúa.
• Trabajo con neuronas y rodajas de tejido. La electrofisiología prolongada y los medios de mantenimiento neuronal recurren de forma habitual al HEPES exactamente por esta razón.

Por el contrario, si un cultivo permanece en un incubador con 5% de CO2, se alimenta dos veces por semana y por lo demás se deja tranquilo, el HEPES añade coste y un riesgo fotoquímico a cambio de muy poco beneficio. No es un aditivo de rutina: es la solución a un problema concreto.

El problema de la luz es real y es el que más a menudo se pasa por alto. Zigler y sus colaboradores demostraron en 1985 que añadir HEPES al RPMI 1640 aumenta notablemente la producción de compuestos citotóxicos cuando el medio se expone a la luz visible, e identificaron el peróxido de hidrógeno como principal agente citotóxico. La reacción solo requiere HEPES y riboflavina más luz; los demás componentes del medio no son necesarios. En sus experimentos, exponer a la luz la mitad del medio de cultivo durante tres horas antes de añadir las células inhibió por completo la incorporación de timidina.

Las reglas prácticas que se derivan son sencillas: conserve en oscuridad las disoluciones madre de HEPES y los medios que lo contengan, mantenga los frascos alejados de la luz prolongada de la mesa de trabajo y fuera de platinas de microscopio iluminadas más tiempo del necesario, y sospeche de cualquier toxicidad inexplicada en un medio suplementado con HEPES que haya permanecido bajo la luz. Casi todos los proveedores suministran el HEPES con la instrucción de conservación «proteger de la luz» por este motivo.

Citotoxicidad dependiente de la concentración. Por encima del intervalo de trabajo de 10-25 mM, el propio HEPES se convierte en un problema para muchos tipos celulares. No existe un umbral único aplicable a todas las líneas; si va a superar los 25 mM, valore el efecto frente a una medida de viabilidad en su propio sistema en lugar de darlo por supuesto.

Interferencia en ensayos. El HEPES no es químicamente inerte en todos los contextos. Participa en reacciones de radicales, puede actuar como reductor frente a algunos óxidos metálicos y su grupo sulfonato puede interferir en determinados ensayos de proteínas y de unión a metales. Cuando un ensayo sensible al tampón da un resultado inesperado, el tampón es un sospechoso legítimo.

El HEPES no sustituye a la esterilidad ni a la estabilidad. No ralentiza la degradación de la glutamina, no impide el crecimiento microbiano y no prolonga la vida útil de un medio.

Para preparar 1 L de HEPES 1 M a partir del ácido libre, disuelva 238,30 g en unos 800 mL de agua de calidad para cultivo celular, valore hasta el pH deseado con hidróxido de sodio (habitualmente 5 M o 10 M, para limitar la dilución), enrase a 1 L y esterilice haciendo pasar la disolución por un filtro de 0,22 µm. Para las disoluciones madre destinadas a cultivo celular se prefiere la esterilización por filtración al autoclavado: el tratamiento térmico puede alterar el color de las disoluciones de HEPES y no aporta ningún beneficio que compense el riesgo.

Aspectos que influyen en la calidad del resultado:

1. Utilice agua de calidad conocida. La disolución madre de HEPES se añade directamente al medio en el que vivirán las células, de modo que el agua pasa íntegra al cultivo. El material de partida adecuado es agua destilada de calidad para cultivo celular con un nivel de endotoxina bajo especificado; el agua desionizada de laboratorio con contenido de endotoxina desconocido, no.
2. Valore a la temperatura a la que va a utilizarla. Véase el apartado sobre el pKa. La lectura a temperatura ambiente no es el valor del incubador.
3. Filtre, no autoclave. Filtro de 0,22 µm, y etiquete con la fecha.
4. Conserve en frío y en oscuridad. De 2 a 8 °C y protegida de la luz son las condiciones habituales para la disolución madre líquida. El polvo es más tolerante y suele conservarse a temperatura ambiente protegido de la luz.
5. Vigile la endotoxina. Los tampones son una vía frecuente, y poco controlada, de entrada de endotoxina en un cultivo. Si su trabajo es sensible a la endotoxina (células inmunitarias primarias, células madre, cualquier proyecto orientado a una aplicación regulada), utilice una disolución madre con una especificación de endotoxina declarada en lugar de una preparada con reactivos sin especificar.

Para los laboratorios que preparan grandes volúmenes de medio a partir de polvo, comprar HEPES a granel en polvo y valorarlo internamente resulta bastante más barato por mol que adquirir disolución estéril 1 M. Para los laboratorios que suplementan unos pocos frascos de medio completo cada vez, la disolución estéril 1 M es la opción pragmática: sin pesada, sin valoración, sin paso de filtración y sin ocasión de contaminar un lote de medio con una disolución madre de preparación propia.