Puromicina para la selección de células de mamífero

La puromicina es un producto natural de Streptomyces alboniger. Suele suministrarse como sal dihidrocloruro (CAS 58-58-2, peso molecular 544.43; la base libre es 471.51), un polvo de color blanco a amarillo pálido muy soluble en agua.

Su mecanismo es de una limpieza poco común, y por eso es un agente de selección predilecto. La puromicina es un análogo estructural del aminoacil-adenosina 3'-terminal del tirosil-ARNt. Como se parece al extremo funcional de un ARNt cargado, se une al sitio A ribosómico y el centro peptidil transferasa transfiere sobre ella la cadena peptídica en crecimiento. En ese punto la analogía se rompe: en un ARNt real el aminoácido está unido mediante un enlace éster que puede hidrolizarse y transferirse, mientras que en la puromicina lo está mediante un enlace amida no hidrolizable. El péptido queda entonces unido covalentemente a una molécula que no puede participar en la siguiente ronda de elongación, de modo que se libera del ribosoma como un fragmento truncado y puromicilado.

De ahí se derivan tres consecuencias, y todas ellas tienen importancia práctica:

• Actúa sobre ribosomas procariotas y eucariotas, por lo que es eficaz en células de mamífero a bajas concentraciones.
• Es rápida. La síntesis de proteínas se interrumpe de inmediato, no tras una acumulación lenta de daño. Las células no resistentes empiezan a morir en 24-48 horas y la selección suele completarse en 2-5 días, mucho más rápido que con G418 o zeocina.
• Se emplea a bajas concentraciones, normalmente 1-2 ug/mL, aproximadamente dos órdenes de magnitud por debajo del G418. Eso supone menos carga osmótica y química para el cultivo y una selección más barata.

Fuera del trabajo de selección, la misma química se aprovecha en los métodos basados en la puromicilación para marcar polipéptidos nacientes, en los que un pulso corto de puromicina etiqueta los ribosomas que están traduciendo activamente.

La resistencia la confiere el gen pac, que codifica la puromicina N-acetiltransferasa (PAC), también de Streptomyces alboniger. La PAC transfiere un grupo acetilo desde el acetil-CoA al grupo amino tirosinilo libre de la puromicina. El producto acetilado ya no puede ser aceptado por el centro peptidil transferasa, de modo que resulta biológicamente inerte.

De esto se desprenden varios puntos prácticos:

• La resistencia es enzimática e intracelular, no una bomba de expulsión ni una mutación de la diana. La célula debe expresar suficiente PAC para destoxificar el fármaco más rápido de lo que este llega. Esto hace que la exigencia de la selección se pueda ajustar razonablemente con la concentración: subir la concentración de puromicina selecciona realmente una mayor expresión del casete de resistencia y, por extensión, una mayor expresión del transgén ligado a él.
• El gen es pequeño, de unos 600 pb, lo que supone una ventaja real en vectores lentivirales y AAV, donde la capacidad de empaquetamiento es limitada. Esta es una de las razones principales por las que la selección con puromicina domina el trabajo con genotecas lentivirales de shRNA y CRISPR.
• La destoxificación es local. Como las células que expresan PAC consumen el fármaco, los cultivos densos de células resistentes pueden proteger parcialmente a las células no resistentes vecinas. Este es el mecanismo que hay detrás del fallo de selección más frecuente, que se comenta más adelante.
• En la bibliografía el marcador se escribe de varias formas —pac, puroR, PuroR—, todas ellas referidas a la misma acetiltransferasa.

La resistencia a la puromicina es dominante y no exige un genotipo concreto del hospedador, a diferencia de algunos sistemas de selección metabólica (por ejemplo, la selección por glutamina sintetasa o por DHFR, que dependen de que el hospedador sea deficiente en la vía correspondiente).

El intervalo de trabajo recomendado para células de mamífero es de 0.5-10 ug/mL, y la mayoría de las líneas celulares se sitúan entre 1 y 5 ug/mL. No existe una cifra universal, y cualquier concentración indicada para una línea celular en un artículo o en un catálogo debe tomarse como punto de partida para la propia curva de mortalidad, nunca como un valor que se pueda adoptar directamente.

Puntos de partida habituales. Muchas líneas adherentes, entre ellas HEK293 y sus derivadas, HeLa y NIH/3T3, se seleccionan bien en torno a 1-2 ug/mL. Muchas líneas CHO se sitúan en un intervalo parecido, a menudo 5-10 ug/mL para las líneas adaptadas a suspensión en medio sin suero. Las células primarias y algunas líneas de células madre son bastante más sensibles y pueden seleccionarse a 0.2-1 ug/mL. Algunas líneas —ciertas líneas murinas y células con una elevada actividad endógena de expulsión de fármacos— necesitan 10 ug/mL o más. Verifique todos estos valores mediante curva de mortalidad.

Qué desplaza la concentración eficaz:

• La densidad celular. Es la variable individual de mayor peso y la que más se pasa por alto. Un cultivo denso consume y diluye el fármaco por célula, de modo que la misma concentración nominal resulta mucho menos eficaz. Realice la curva de mortalidad a la densidad que vaya a usar realmente para la selección.
• El contenido de suero. Las proteínas séricas unen puromicina en cierta medida, así que un cultivo en 10% de FBS suele necesitar más fármaco que las mismas células en medio sin suero o con suero reducido. Pasar una selección de medio con suero a medio sin suero exige normalmente reoptimizar a la baja.
• El tiempo de duplicación. La puromicina mata a las células que están traduciendo. Los cultivos de crecimiento lento, confluentes o quiescentes mueren más despacio y de forma menos completa, y por eso la selección debe iniciarse sobre un cultivo subconfluente y en división activa.
• El lote de puromicina. La potencia varía entre lotes y se degrada con el almacenamiento. Repita una curva de mortalidad abreviada al abrir un lote nuevo.
• El pH del medio. La puromicina es menos estable a pH alcalino. Un cultivo que se ha alcalinizado por un mal control del CO2 pierde presión de selección más rápido de lo esperado.

Cuándo iniciar la selección. Tras la transfección, deje pasar 48-72 horas en medio de crecimiento normal antes de añadir la puromicina. Las células necesitan tiempo para expresar el casete de resistencia; añadir el fármaco demasiado pronto mata a las células transfectadas con éxito antes de que la PAC se haya acumulado. Tras una transducción lentiviral, 24-48 horas suelen bastar, ya que la expresión desde un provirus integrado se establece rápidamente.

Una curva de mortalidad es un experimento de dosis-respuesta que identifica la concentración mínima que mata al 100% de las células no transfectadas dentro de la ventana de selección prevista. Usar más de esa cantidad no es más seguro: aumenta la probabilidad de matar clones realmente resistentes pero de menor expresión y añade estrés inespecífico.

Realícela sobre células parentales no transfectadas de la línea exacta, el rango de pases y el medio que vaya a emplear en la selección real.

Día 0 — sembrar

1. Recolecte células parentales sanas, subconfluentes y en crecimiento exponencial, con una viabilidad superior al 90%.
2. Siembre una placa de 24 pocillos a una densidad que alcance en torno al 50-70% de confluencia al día siguiente, normalmente 2-5 x 10^4 células por pocillo para una línea adherente de crecimiento rápido. Siembre pocillos suficientes para 8 concentraciones por duplicado o triplicado.
3. Ajuste la densidad de siembra a la densidad de selección prevista. Una curva de mortalidad realizada sobre células dispersas subestimará la concentración necesaria en una placa densa.
4. Incube toda la noche en medio de crecimiento normal sin puromicina para que las células se adhieran y reanuden la división.

Día 1 — aplicar la serie de dosis

5. Prepare una serie de diluciones en medio de crecimiento completo. Una serie estándar es 0 (control sin tratar), 0.25, 0.5, 1, 2, 5, 10 y 20 ug/mL. Para una línea celular que se prevea sensible, desplace la serie hacia abajo (de 0 a 5 ug/mL); para una línea que se prevea resistente, extiéndala hacia arriba.
6. Aspire y sustituya el medio de cada pocillo por el que contiene la concentración de puromicina correspondiente. El control sin fármaco es imprescindible: indica si la muerte observada se debe al fármaco o a las condiciones de cultivo.

Días 2-10 — mantener y observar

7. Sustituya el medio de selección cada 2-3 días por puromicina recién preparada a la misma concentración. Este es el paso que más a menudo se omite y su omisión invalida el resultado: la puromicina pierde actividad en el medio a 37 C en unos pocos días, y las células que mueren liberan restos y proteasas que reducen aún más la potencia efectiva.
8. Examine a diario por contraste de fases. Registre la proporción de células redondeadas, desprendidas o flotantes en cada pocillo. Fotografíelas si desea dejar constancia.
9. Continúe hasta 10 días, o hasta que el control sin tratar alcance la confluencia y deba detenerse.

Interpretar el resultado

10. Identifique la concentración mínima a la que no queda ninguna célula viable y anote el día en que se alcanzó. Con puromicina suele ser el día 2-5.
11. Confírmelo mediante recuento con azul de tripano o con una tinción de viabilidad, en lugar de solo a simple vista, si los pocillos resultan ambiguos.
12. Utilice esa concentración para la selección. Muchos laboratorios mantienen después las líneas estables ya establecidas a la mitad de la concentración de selección, para conservar la presión selectiva sin un estrés intenso continuo.

Comprobaciones básicas. Si el control sin tratar no está sano, toda la curva es ininterpretable: repítala. Si no muere nada ni siquiera a 20 ug/mL, compruebe que el fármaco se añadió, que la disolución madre no está degradada y que las células no llevan ya un marcador de resistencia de un trabajo anterior. Si muere todo, incluido el control, revise el medio, la placa y el incubador antes de culpar al fármaco.

Momento de inicio. Añada la puromicina 48-72 horas después de la transfección o 24-48 horas después de la transducción. Las células no resistentes deberían morir de forma visible en 24-48 horas y haber desaparecido en su mayor parte hacia el día 3-5.

Renueve el fármaco. Cambie el medio de selección cada 2-3 días durante todo el proceso. Además de mantener la potencia, así se retira la gran cantidad de restos generados por la muerte celular masiva, que de otro modo asfixian a las colonias supervivientes.

Mantenga un control de mortalidad. Cultive células parentales no transfectadas en puromicina junto a cada selección. Cuando estén completamente muertas, la presión de selección queda demostrada para ese experimento concreto. Sin ese control, una placa de células supervivientes es ambigua: pueden ser resistentes, o bien el fármaco puede simplemente haber fallado.

La densidad es el modo de fallo habitual. Como las células que expresan PAC destruyen la puromicina, una población densa de células resistentes crea zonas locales en las que la concentración del fármaco baja lo suficiente para que sobrevivan las células no resistentes. Los síntomas son un tapiz de fondo de células no transfectadas que no acaba de desaparecer y colonias que no se expanden con limpieza. La solución es mantener el cultivo subconfluente durante la selección, subcultivar cuando se vuelva denso sin retirar el fármaco y cambiar el medio con frecuencia.

Duración prevista. La selección suele completarse en 3-7 días. Si va a aislar clones, mantenga la presión selectiva durante la expansión de las colonias. Para poblaciones agrupadas, una vez que el control de mortalidad esté limpio, la población puede expandirse.

Mantenimiento. Las líneas estables ya establecidas se mantienen a menudo a la mitad de la concentración de selección, o se someten a ciclos —cultivo sin fármaco y retorno periódico a la selección— para reducir el estrés crónico. Las líneas celulares pueden silenciar con el tiempo los casetes integrados, así que verifique la expresión periódicamente en lugar de suponer que la selección continuada la garantiza.

Una advertencia sobre cómo interpretar la supervivencia. La puromicina selecciona células que expresan PAC. No selecciona la expresión de lo demás que haya en su construcción. El silenciamiento de un transgén situado aguas abajo mientras el marcador de resistencia permanece activo es frecuente, sobre todo con promotores internos débiles o casetes ligados por IRES. Confirme siempre la expresión del gen que le interesa mediante un ensayo independiente.

Preparación de la disolución madre. El dihidrocloruro de puromicina es muy soluble en agua. La disolución madre estándar es de 10 mg/mL en agua estéril o en solución salina tamponada con HEPES, esterilizada por filtración a través de 0.22 um. Existen ampliamente disponibles disoluciones ya preparadas de 10 mg/mL, que evitan tener que pesar un polvo peligroso.

El pH importa. La puromicina es más estable en disolución de ligeramente ácida a neutra, en torno a pH 6.0-7.0, y se degrada de forma apreciable en condiciones alcalinas. No prepare la disolución madre en un tampón alcalino y evite guardarla en un medio que se haya alcalinizado por pérdida de CO2.

Almacenamiento.

• Polvo: -20 C, desecado y protegido de la luz.
• Disolución acuosa a 10 mg/mL: -20 C, protegida de la luz y en alícuotas de un solo uso. Estable durante aproximadamente un año en estas condiciones.
• Disolución de trabajo a corto plazo: 2-8 C hasta cerca de un mes.
• Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación. Cada ciclo cuesta potencia, y una disolución madre descongelada una docena de veces es una causa oculta frecuente de selección fallida. Reparta en alícuotas de 100-500 uL en la primera descongelación.

En el medio de cultivo. La puromicina pierde actividad en medio completo a 37 C a lo largo de varios días. Esta es la razón del cambio de medio cada 2-3 días durante la selección y las curvas de mortalidad. No prepare un gran lote de medio de selección para usarlo durante dos semanas.

Luz. Proteja las disoluciones madre de la exposición prolongada a la luz. Basta con envolver los tubos en papel de aluminio.

Manipulación. La puromicina es un inhibidor de la síntesis de proteínas y es tóxica. Manipule el polvo en una vitrina de gases o en una cabina de seguridad biológica, con guantes y protección ocular, para evitar inhalar el polvo, y deseche las disoluciones como residuo químico. Siempre que sea posible, es preferible pesar disolución ya preparada a manipular el polvo.

La puromicina es la opción por defecto en la mayor parte del trabajo con líneas estables porque es rápida, barata, eficaz a baja concentración y va asociada a un gen pequeño. No siempre es la elección correcta.

Opte por la puromicina cuando quiera la selección más corta posible, trabaje con un vector viral en el que el tamaño del inserto esté limitado o esté seleccionando una genoteca agrupada, donde la rapidez reduce la deriva.

Opte por otra cosa cuando:

• Necesite un segundo o un tercer marcador. La selección secuencial o simultánea de varias construcciones exige agentes ortogonales: puromicina más blasticidina más higromicina es un trío frecuente, ya que sus mecanismos de resistencia no se solapan.
• Su línea celular sea intrínsecamente resistente a la puromicina o requiera una concentración tan alta que la toxicidad inespecífica se convierta en un problema.
• Necesite una selección muy exigente y lenta para obtener clones de alta expresión. La selección con G418 es más lenta y algunos grupos consideran que, por ese motivo, enriquece mejor en células estables de alta expresión.
• Trabaje con células que tengan una elevada actividad de expulsión de múltiples fármacos, en las que la puromicina puede exportarse activamente.

Una nota sobre la zeocina, que se comporta de forma distinta a las demás: es un glucopéptido que escinde el ADN y no un inhibidor de la traducción, requiere medio de baja concentración salina a pH 7.0-7.5 para su actividad plena y es muy sensible a la luz. Una selección fallida con zeocina se debe muy a menudo a un problema de composición del medio y no de dosis.

Sea cual sea el agente empleado, la exigencia de la curva de mortalidad es idéntica. Cada agente, cada línea celular, cada lote nuevo.