Tripsina frente a Accutase: cómo elegir un reactivo de disociación celular

La tripsina es una serina proteasa del páncreas que se suministra para cultivo celular como extracto de páncreas porcino o bovino, o bien como proteína recombinante. Hidroliza los enlaces peptídicos del lado carboxilo de los residuos de lisina y arginina, y funciona bien a 37 °C y a pH ligeramente alcalino.

En la disociación hace dos cosas a la vez. Digiere los dominios extracelulares de las proteínas de adhesión que anclan las células a la superficie de cultivo y entre sí, y digiere todo lo demás que haya en la superficie celular y presente una lisina o una arginina accesible. Este segundo efecto es la razón entera de que existan alternativas.

El «1:250» de una etiqueta de tripsina es una designación de potencia, no una dilución ni una declaración de pureza: significa que una parte de la preparación digiere 250 partes de caseína en el ensayo estandarizado. No dice nada sobre lo demás que contiene el frasco. Las preparaciones pancreáticas crudas llevan además quimotripsina, elastasa, carboxipeptidasas y otras actividades pancreáticas, y varían de un lote a otro. Conviene saberlo cuando un protocolo se comporta de forma distinta de repente al abrir un frasco nuevo. La tripsina recombinante, producida por fermentación, es un único componente definido y no arrastra esa variabilidad.

Las formulaciones estándar son sencillas. El Trypsin-EDTA al 0.25% de Gibco contiene 2.5 g/L de tripsina (1:250) con 0.38 g/L de EDTA tetrasódico —alrededor de 1 mM— en una solución salina equilibrada sin calcio ni magnesio. La versión al 0.05% contiene 0.5 g/L de tripsina con 0.2 g/L de EDTA tetrasódico, unos 0.53 mM. El EDTA no es un relleno: quela los cationes divalentes que necesitan las cadherinas y las integrinas, de modo que enzima y quelante atacan las mismas adhesiones por vías distintas.

Accutase es una solución de despegado celular de Innovative Cell Technologies. Sus componentes activos se describen como una mezcla de enzimas proteolíticas y colagenolíticas procedentes de una especie de invertebrado. La identidad exacta de las enzimas y sus concentraciones son propietarias y no están publicadas, así que ninguna comparación honesta puede citar una actividad en unidades para este producto: quien lo haga está adivinando.

Lo que sí se declara es la matriz. Las enzimas se suministran en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio ni magnesio, con 0.5 mM de EDTA tetrasódico y 3 mg/L de rojo de fenol. El producto no contiene componentes de origen mamífero ni bacteriano, que es la base de su uso allí donde el material de origen animal supone un problema regulatorio.

Del diseño se derivan tres propiedades prácticas. Es activo tanto a temperatura ambiente como a 37 °C, de modo que la disociación puede realizarse más fría y más lenta cuando eso favorece la viabilidad. No requiere neutralización con suero ni con un inhibidor de proteasas: el flujo de trabajo estándar consiste en diluir en medio y sedimentar. Y es claramente más suave con las proteínas de superficie que la tripsina, que es la propiedad por la que en realidad se paga.

El coste es la velocidad. Accutase suele necesitar más tiempo que la tripsina para liberar la misma monocapa y, en líneas firmemente adheridas, puede no liberarlas por completo.

La pregunta suele plantearse como tripsina frente a Accutase, pero hay otros dos reactivos que forman parte de la decisión.

TrypLE es una proteasa recombinante de tipo tripsina producida por fermentación microbiana y vendida como sustituto libre de origen animal de la tripsina porcina. Igual que en Accutase, su concentración enzimática es propietaria. Se sitúa entre la tripsina y Accutase en agresividad, es estable a temperatura ambiente tanto para el almacenamiento como para su uso, y es la sustitución directa cuando un proceso necesita eliminar material de origen animal sin rediseñar el flujo de trabajo. Está disponible con y sin EDTA y con y sin rojo de fenol.

El EDTA solo —vendido como Versene a 0.48 mM de EDTA en PBS, o como una solución de EDTA 0.5 mM en solución salina sin calcio ni magnesio— no contiene enzima alguna. Actúa exclusivamente quelando Ca2+ y Mg2+, con lo que colapsa las uniones célula-célula mediadas por cadherinas y la adhesión mediada por integrinas sin cortar nada. Nada de la superficie celular se digiere, por lo que la conservación de los epítopos es completa.

La contrapartida es que el EDTA solo no libera del todo las células de la matriz en muchos sistemas, y las levanta en agregados en lugar de como células individuales. Para las células madre pluripotentes humanas eso es una ventaja y no un defecto: el pase en agregados con EDTA es el método rutinario estándar precisamente porque las hPSC sobreviven mejor como agregados que como células individuales.

Si las células que recoge van a volver directamente a un frasco, la química de la disociación apenas importa: las proteínas de superficie se vuelven a expresar en unas pocas horas. Si las células que recoge son la medida, importa muchísimo.

La tripsina corta los dominios extracelulares de muchas proteínas de superficie que se utilizan como marcadores de identidad y de linaje. Entre los epítopos descritos con frecuencia como sensibles a tripsina están CD4, CD8, CD14, CD19, CD31, CD62L (L-selectina), CXCR4 y varias integrinas. Ahora bien, la sensibilidad depende tanto del clon de anticuerpo como del antígeno: dos anticuerpos generados contra el mismo marcador pueden comportarse de forma completamente distinta tras la tripsinización, porque reconocen epítopos diferentes de ese marcador.

La consecuencia es un resultado de citometría de flujo que informa de un fenotipo que las células no tienen. Una población clasificada como negativa para un marcador puede simplemente haber perdido el epítopo durante la recogida. Este fallo es silencioso: el histograma parece una población negativa auténtica y nada en los datos lo señala.

Hay tres salidas. Utilizar EDTA solo o Accutase para la recogida. O bien, cuando la tripsina es inevitable, dejar que las células se recuperen en medio completo antes del marcaje, para que el proteoma de superficie vuelva a expresarse. O validarlo directamente, marcando la misma muestra recogida de las dos formas y comparando: el único enfoque que realmente lo demuestra para su panel concreto.

Un punto relacionado que es fácil pasar por alto: sea cual sea el reactivo elegido, manténgalo constante a lo largo de todo el experimento. Una muestra tratada recogida con tripsina y un control recogido con Accutase no forman una comparación controlada, por muy igualado que esté todo lo demás.

Los dos sentidos del error salen caros.

La digestión excesiva —demasiado tiempo, demasiado concentrada o demasiado caliente— daña la membrana plasmática. Los signos visibles son la formación de vesículas de membrana, la granularidad y células que se redondean pero nunca forman un sedimento limpio. Los costes medibles son la pérdida de viabilidad, la menor eficiencia de sembrado en el pase siguiente y un perfil de marcadores distorsionado. La tripsina no deja de actuar por sí sola, y por eso el paso de neutralización no es opcional y por eso la mayor parte de la digestión excesiva ocurre en realidad entre el final de la incubación y el momento en que se añade el medio.

La digestión insuficiente produce agregados. Los agregados arruinan los recuentos en cámara y los automáticos, que a su vez producen una siembra desigual en la placa. En la secuenciación de célula única basada en gotas provocan multipletes y obstruyen la microfluídica. En citometría de flujo se eliminan mediante la exclusión de dobletes, de modo que las células que se agregaron se pierden del análisis sin que nada lo indique; y si la formación de agregados no es aleatoria respecto al tipo celular, esa pérdida está sesgada y no es solo una muestra más pequeña.

El enfoque práctico es fijar el tiempo de incubación por observación y no por protocolo. Revise la monocapa al microscopio desde el primer momento plausible y deténgase cuando aproximadamente el 80-90% de las células se hayan redondeado, lo que suele ocurrir antes de que se hayan desprendido por completo; un golpe firme en el lateral del frasco libera el resto. Añada el medio de inmediato en ese punto.

La temperatura es una palanca real. La tripsina a temperatura ambiente es mucho más lenta que a 37 °C, lo que resulta útil de vez en cuando con células frágiles. Accutase y TrypLE están diseñados para actuar a temperatura ambiente.

Una advertencia más: las disoluciones de tripsina pierden actividad con los ciclos repetidos de congelación y descongelación. Alicuote al recibirlas en lugar de meter y sacar del congelador un frasco de 500 mL, o un protocolo que funcionaba en enero dejará de funcionar en junio y nadie sabrá por qué.

Líneas adherentes robustas para subcultivo rutinario: HEK293, HeLa, CHO, la mayoría de líneas fibroblásticas y epiteliales. Trypsin-EDTA al 0.25% o al 0.05% es la opción sensata por defecto: la más rápida, la más barata, y el daño a los epítopos es irrelevante si las células vuelven al cultivo. Use el 0.05% para líneas que se despegan con facilidad y el 0.25% para las más tenaces.

Células madre pluripotentes humanas (iPSC y ESC). EDTA solo para el pase rutinario en agregados; Accutase o un reactivo de disociación específico para células madre cuando realmente se necesitan células individuales, como en trabajo clonal, transfección o separación celular. La disociación a célula única de las hPSC desencadena apoptosis inducida por disociación, y es práctica estándar incluir un inhibidor de ROCK como Y-27632 para evitarlo: Watanabe y colaboradores describieron un aumento de la eficiencia de clonación desde alrededor del 1% hasta alrededor del 27% al usarlo. La tripsina es una mala elección para estas células en cualquiera de los dos modos.

Neuronas primarias y otras células primarias frágiles. Accutase o un reactivo suave sin enzimas. Las neuronas son especialmente sensibles tanto a la digestión excesiva como a la trituración mecánica que viene después.

Células destinadas a citometría de flujo sobre marcadores de superficie. EDTA solo si consigue liberarlas, Accutase si no lo consigue, y tripsina únicamente con un periodo de recuperación y un panel validado.

Células estromales mesenquimales y otras células para terapia celular o procesos próximos a GMP. Un reactivo libre de origen animal —tripsina recombinante, TrypLE o Accutase— elimina el material porcino y la carga de ensayos de agentes adventicios que lo acompaña.

Preparaciones para secuenciación de célula única. Lo que dé la suspensión de células individuales más limpia con la mayor viabilidad para ese tejido, establecido de forma empírica. Lo más suave suele ser mejor, pero una muestra disociada de forma incompleta es peor que una tratada algo más bruscamente.

Lave primero, con una solución sin calcio ni magnesio. El suero contiene alfa-1-antitripsina y alfa-2-macroglobulina, que inhiben la tripsina, de modo que el suero residual frena la digestión. Un lavado con DPBS sin Ca/Mg elimina el suero y empieza a retirar cationes divalentes de las uniones. Lavar en este paso con una solución que contenga Ca/Mg juega directamente en su contra.

Use solo el volumen justo para cubrir la monocapa. Basta con una película fina: normalmente 1 mL para un T-25 y 2-3 mL para un T-75. El exceso de reactivo cuesta dinero y no mejora nada.

Neutralice bien la tripsina. Lo habitual es medio completo con suero. En cultivo sin suero, utilice un inhibidor de tripsina de soja definido en lugar de confiar en la dilución; la dilución ralentiza la enzima, pero no la detiene.

Accutase no necesita neutralización, pero sí hay que retirarlo. Diluya en medio, sedimente y resuspenda, en vez de dejar las células dentro del reactivo mientras hace otra cosa.

Sedimente con suavidad. Unos 200-300 × g durante 5 minutos van bien para la mayoría de las líneas de mamífero. Centrifugar con más fuerza tras una digestión agresiva agrava el daño de membrana en lugar de compensarlo.

Mantenga un protocolo escrito y específico para cada línea que recoja reactivo, concentración, temperatura, tiempo y el punto final visual. La disociación es el paso que con más facilidad se desvía de forma silenciosa entre operadores, y está aguas arriba de todo lo demás que se mide.