Tampones para cultivo celular

La mayoría de las células de mamífero crecen mejor entre pH 7,2 y 7,4, y la banda tolerable es más estrecha de lo que se suele suponer. Los óptimos publicados varían según el tipo celular —a menudo se describe que las líneas transformadas prefieren la parte baja del intervalo, en torno a pH 7,0-7,4, y los fibroblastos normales la parte alta, en torno a 7,4-7,7—, pero en todos los casos la ventana de trabajo tiene unas pocas décimas de unidad de pH.

Mantener esa ventana no es algo pasivo. Las células acidifican continuamente su medio: la glucólisis produce lactato y la respiración produce dióxido de carbono. En un cultivo denso la carga ácida es considerable, y por eso un frasco sobreconfluente amarillea en un día. La función de un tampón es absorber esa carga sin dejar que el pH salga de la ventana antes de la siguiente alimentación.

Un tampón resiste los cambios de pH con la máxima eficacia dentro de aproximadamente una unidad de pH a cada lado de su propio pKa, de modo que un tampón para cultivo celular necesita un pKa cercano a 7,4. Ese único requisito descarta de inmediato la mayoría de los tampones de laboratorio. Lo que queda debe cumplir además varias condiciones: no debe atravesar la membrana plasmática y tamponar el citoplasma, no debe quelar el calcio, el magnesio, el cinc ni el hierro que aporta la formulación, no debe absorber luz de forma que interfiera con los ensayos, debe ser estable en disolución y no tóxico a la concentración de trabajo, y debe resultar asequible a escala de litros.

El Tris ilustra lo que ocurre cuando no se cumplen estas condiciones. Tiene un pKa de 8,06 a 25 grados C, ya demasiado alto, un coeficiente de temperatura de -0,028 unidades de pH por grado C, aproximadamente el doble que el del HEPES, y suficiente solubilidad lipídica para permear las membranas, que es precisamente por lo que resulta tóxico para muchas células de mamífero y no se usa en cultivo celular pese a ser omnipresente en bioquímica.

Hay una segunda especificación que se olvida con facilidad: la osmolalidad. Un tampón que corrige el pH mientras empuja la osmolalidad total fuera del intervalo de 260-320 mOsmol/kg que toleran las células de mamífero no ha resuelto el problema. La elección del tampón y la osmolalidad son la misma conversación.

El tampón por defecto en los medios clásicos es el bicarbonato de sodio combinado con CO2 gaseoso, y se usa por buenas razones: es el tampón fisiológico, es barato y el bicarbonato es además un nutriente que las células consumen en reacciones de carboxilación.

La química es un equilibrio acoplado. El dióxido de carbono se disuelve en el medio y se hidrata a ácido carbónico, que se disocia en bicarbonato y un protón. El pKa aparente del sistema del ácido carbónico en condiciones fisiológicas es 6,1, y el pH resultante se describe mediante la relación de Henderson-Hasselbalch:

pH = 6,1 + log( [HCO3-] / (0,03 x pCO2) )

donde pCO2 se expresa en mmHg y 0,03 es el coeficiente de solubilidad del CO2 en mmol/L por mmHg.

La consecuencia importante es que el pH lo fija la relación entre bicarbonato y CO2 disuelto, no cada uno por separado. Ni el bicarbonato de sodio de la formulación ni el CO2 del incubador determinan el pH por sí solos. Lo determinan conjuntamente, y por eso deben especificarse juntos.

Esto explica también la debilidad central del sistema. El CO2 es volátil. El aire ambiente contiene alrededor de un 0,04 % de CO2 frente al 5 % o el 10 % del incubador, de modo que en cuanto se saca un frasco el CO2 disuelto abandona el medio mientras el bicarbonato permanece. La relación aumenta, y el pH con ella. Bajo una campana de flujo laminar, un medio tamponado con bicarbonato puede virar visiblemente hacia la alcalinidad en diez o veinte minutos.

Una tercera consideración: las disoluciones de bicarbonato son químicamente inestables en recipiente abierto. El bicarbonato de sodio se añade al final de la preparación del medio, y los medios en polvo suelen suministrarse sin él precisamente para poder añadirlo recién preparado.

Este es el error de configuración más frecuente en cultivo celular, y merece la pena hacer una sola vez la aritmética que lo evita.

Tomemos un incubador al 5 % de CO2 a nivel del mar. Corrigiendo por el vapor de agua a 37 grados C, la pCO2 es de unos 0,05 x (760 - 47) = 36 mmHg, de modo que el CO2 disuelto es de unos 0,03 x 36 = 1,1 mmol/L. Para un pH objetivo de 7,4:

log([HCO3-] / 1,1) = 7,4 - 6,1 = 1,3, de modo que [HCO3-] = 1,1 x 20 = 22 mmol/L, es decir, 1,8 g/L de bicarbonato de sodio (MW 84,01).

Repitiendo el cálculo al 10 % de CO2, el CO2 disuelto se duplica hasta 2,1 mmol/L y se requieren unos 43 mmol/L de bicarbonato: 3,6 g/L.

Esas cifras no son casuales. Son la razón por la que el DMEM estándar se formula con 3,7 g/L de bicarbonato de sodio y está diseñado para un incubador al 10 % de CO2, y por la que las formulaciones de 1,5-2,2 g/L están diseñadas para el 5 % de CO2. El RPMI 1640 a 2,0 g/L es un medio para 5 % de CO2.

Medio / disolución	NaHCO3	mM aprox.	Atmósfera prevista
DMEM (estándar)	3,7 g/L	44	10 % CO2
DMEM (variantes para 5 % CO2)	1,5-2,2 g/L	18-26	5 % CO2
RPMI 1640	2,0 g/L	24	5 % CO2
EBSS (de Earle)	2,2 g/L	26	5 % CO2
HBSS (de Hanks)	~0,35 g/L	~4	Aire ambiente
DPBS / PBS	ninguno	0	Aire ambiente (tamponado con fosfato)

Usar una formulación de 3,7 g/L al 5 % de CO2 deja el medio permanentemente alcalino —normalmente derivando hacia pH 7,6-7,8—, algo que las células toleran mal y que se manifiesta como un medio obstinadamente rosa-púrpura que nunca amarillea, ni siquiera en un cultivo denso. Lo contrario, un medio bajo en bicarbonato al 10 % de CO2, produce una acidosis persistente.

La altitud también influye, y se pasa por alto con frecuencia. El cálculo anterior emplea 760 mmHg. A 1500 m, la presión atmosférica es de aproximadamente 630 mmHg, de modo que el mismo ajuste del 5 % de CO2 aporta alrededor de un 17 % menos de CO2 disuelto y el medio se sitúa a un pH más alto. Los laboratorios situados en altura suelen trabajar con un porcentaje de CO2 más elevado para compensarlo.

Los tampones zwitteriónicos descritos por Norman Good y sus colaboradores se seleccionaron atendiendo exactamente a los criterios enumerados al principio de esta página, y son la respuesta al problema de la volatilidad del sistema del bicarbonato.

El HEPES es el que se encuentra habitualmente. pKa 7,48 a 25 grados C, intervalo útil de aproximadamente pH 6,8-8,2, concentración de trabajo de 10-25 mM en cultivo. Como ninguno de los dos miembros de su par ácido/base es un gas, su capacidad tamponante queda fijada por la cantidad añadida y no se ve afectada por la atmósfera. Eso lo convierte en el aditivo estándar para la microscopía de células vivas sin control de gases, la clasificación celular, la disociación de tejidos en la mesa de trabajo, el transporte de cultivos vivos y cualquier protocolo con pasos de manipulación prolongados.

Se aplican tres advertencias. El HEPES reacciona fotoquímicamente con la riboflavina del medio bajo luz visible y produce peróxido de hidrógeno, de modo que los medios con HEPES deben conservarse y manipularse protegidos de la luz. Es citotóxico por encima del intervalo de trabajo. Y es únicamente un tampón: no aporta nada desde el punto de vista nutricional, por lo que complementa al bicarbonato en lugar de sustituirlo.

El MOPS tiene un pKa de 7,20 y tampona de forma útil entre aproximadamente pH 6,5 y 7,9. Aparece en formulaciones especializadas y microbianas y en algunos trabajos de electroforesis y de proteínas, pero no ha desplazado al HEPES en el cultivo de células de mamífero.

Otros miembros de la familia —TES, BES, PIPES, TAPS— se sitúan en distintos puntos del intervalo fisiológico y se eligen en trabajos bioquímicos donde se necesita un pKa concreto. Rara vez se usan en medios de crecimiento.

La regla general para los tampones orgánicos en cultivo es que son complementos, no sustitutos. Eliminar el bicarbonato en favor del HEPES por sí solo frenará o detendrá el crecimiento en muchas líneas, porque el bicarbonato es un sustrato además de un tampón. La configuración estándar es bicarbonato ajustado al incubador, más un tampón orgánico cuando el trabajo lo exige.

El fosfato es un auténtico tampón fisiológico con un pKa conveniente. La disociación relevante, de dihidrogenofosfato a hidrogenofosfato, tiene un pKa de 7,20, lo que sitúa el intervalo fisiológico de lleno dentro de su banda útil.

El contenido total de fosfato difiere más de lo que la mayoría espera entre los dos frascos que conviven en cualquier estantería. Un PBS estándar a pH 7,4 aporta unos 4,0 mM de fosfato total, mientras que la formulación de Dulbecco (DPBS) aporta unos 9,5 mM, bastante más del doble. Por tanto, el DPBS resiste considerablemente mejor un desplazamiento del pH cuando se le añaden células, un reactivo ácido o un volumen de medio, lo que es una razón práctica para preferirlo en cualquier cosa que vaya más allá de un enjuague rápido.

Concentraciones de calcio y magnesio, para las versiones que los contienen:

Disolución	Calcio (Ca2+)	Magnesio (Mg2+)	Fosfato total
PBS pH 7,4	ninguno	ninguno	~4,0 mM
DPBS, sin Ca/Mg	ninguno	ninguno	~9,5 mM
DPBS, con Ca/Mg	0,90 mM (CaCl2 100 mg/L)	0,49 mM (MgCl2.6H2O 100 mg/L)	~9,5 mM
HBSS, con Ca/Mg	1,26 mM (CaCl2 140 mg/L)	0,90 mM (MgCl2.6H2O 100 + MgSO4.7H2O 100 mg/L)	~0,78 mM

Para qué sirven realmente los cationes divalentes. No están ahí para tamponar nada: mantienen las células adheridas. Las integrinas necesitan un catión divalente en su sitio de adhesión dependiente de ion metálico para unirse a la matriz, y las cadherinas necesitan calcio para mantener la conformación extracelular rígida que les permite unirse entre sí. Por tanto, un lavado con calcio mantiene la monocapa pegada y conserva intactas las uniones intercelulares; un lavado sin calcio empieza a aflojar ambas cosas en el momento en que se añade. El calcio y el magnesio también son necesarios para las enzimas de disociación metaloproteasas, la dispasa y la colagenasa, motivo por el cual estas se diluyen en una disolución con Ca/Mg.

Una consecuencia que conviene conocer: los fosfatos de calcio y de magnesio tienen una solubilidad limitada, de modo que las soluciones salinas de fosfato con calcio son propensas a precipitar en los concentrados 10X y durante el autoclavado. La esterilización por filtración a 0,22 micras es la vía más segura para cualquier solución salina de fosfato que contenga calcio.

Las disoluciones tamponadas con fosfato son los caballos de batalla de la manipulación: lavar monocapas antes de la tripsinización, diluir reactivos, enjuagar, transportar brevemente y resuspender células para el recuento. Son sencillas, estables, económicas y no requieren gas de incubador.

No son medios de crecimiento, y conviene explicitar las razones.

El fosfato tiene una capacidad tamponante limitada frente a una carga ácida metabólica real. No aporta carbono, ni aminoácidos, ni vitaminas y, en la mayoría de las formulaciones, tampoco glucosa. A concentraciones más altas, el fosfato precipita con el calcio en forma de fosfato de calcio, razón por la cual las formulaciones con calcio y magnesio existen como productos separados de las libres de Ca/Mg y por la que no conviene aumentar a la ligera el contenido de fosfato. Y las disoluciones sin bicarbonato privan a las células de un sustrato que necesitan.

La distinción entre con y sin calcio/magnesio es la que más confunde. El DPBS sin Ca/Mg es el lavado correcto antes de la tripsinización, porque los cationes divalentes son justamente lo que el EDTA de la tripsina-EDTA está ahí para eliminar: lavar con una formulación que contenga calcio inmediatamente antes juega en contra del reactivo de disociación. El DPBS con Ca/Mg es el diluyente correcto cuando hay que preservar la adhesión y la actividad enzimática dependiente de cationes, lo que incluye diluir la dispasa y la colagenasa, ambas metaloproteasas dependientes de calcio.

Para los pasos de manipulación que requieren algo más de sostén que el PBS —mantenimiento breve de tejido, incubaciones cortas, tampones de disociación—, una solución salina equilibrada como el HBSS o el EBSS es la mejor opción, porque aporta glucosa y un bajo contenido de bicarbonato junto con las sales.

El rojo de fenol no es un tampón. Es un indicador de pH incluido en la mayoría de los medios a aproximadamente 15 mg/L para poder leer de un vistazo el estado de un cultivo.

Sus transiciones de color son:

• Amarillo por debajo de aproximadamente pH 6,8: el medio está ácido. En un cultivo esto suele significar una densidad celular elevada con acumulación de lactato, o bien contaminación bacteriana; ambas cosas requieren atención inmediata y no en la siguiente alimentación programada.
• Naranja a rojo en el intervalo pH 7,0-7,4: el intervalo de trabajo. Un cultivo sano se mantiene rojo y vira hacia el naranja a medida que se hace denso.
• Rosa a púrpura por encima de aproximadamente pH 8,2: el medio está alcalino. Las causas habituales son un desajuste bicarbonato/CO2, un incubador que se ha quedado sin suministro de CO2, una puerta que quedó abierta o un frasco que sencillamente lleva demasiado tiempo fuera.

Hay dos limitaciones importantes. Primera, el rojo de fenol es un instrumento tosco: mostrará un problema de varias décimas de unidad de pH, pero no distinguirá pH 7,2 de 7,4, y juzgar el color a simple vista es subjetivo bajo distintas iluminaciones. Si el pH es una variable experimental, hay que medirlo.

Segunda, el rojo de fenol no es biológicamente inerte. Tiene una débil actividad estrogénica y puede unirse a los receptores de estrógenos, lo que constituye un factor de confusión real en sistemas sensibles a hormonas, en particular en las líneas de cáncer de mama. Además emite fluorescencia y absorbe en intervalos que interfieren con los ensayos basados en fluorescencia y con las lecturas de absorbancia. Por eso existen versiones sin rojo de fenol de prácticamente todos los medios y reactivos: son para el trabajo hormonal, la microscopía y los ensayos en lector de placas, y elegir una es una decisión deliberada de renunciar a la lectura visual del pH a cambio de un fondo más limpio.

Un tampón vale lo que vale el frasco del que salió, y las disoluciones madre concentradas son el punto por donde entra en un laboratorio la mayor parte de la variabilidad evitable. Hay unas cuantas reglas que se aplican a toda la estantería.

Alicuotar todo lo que se vaya a usar repetidamente. Cada regreso a un frasco madre es una oportunidad de contaminarlo, y en todo lo enzimático cada ciclo de congelación-descongelación cuesta actividad. Conviene fraccionarlo al recibirlo en volúmenes ajustados a la forma real de trabajar.

Filtrar, no autoclavar, todo lo termosensible. Esto abarca más reactivos de lo que se supone: las enzimas se destruyen por completo, la glucosa y otros azúcares reductores pardean en presencia de grupos amino, las soluciones salinas de fosfato con calcio precipitan y las disoluciones de HEPES se decoloran. La esterilización por filtración a 0,22 micras es la opción por defecto para las disoluciones madre de cultivo celular.

Proteger de la luz las disoluciones madre fotosensibles. El HEPES es el caso importante en el contexto de los tampones, porque genera peróxido de hidrógeno por vía fotoquímica junto con la riboflavina, pero la indicación aparece en muchas etiquetas de reactivos y conviene seguirla en lugar de racionalizarla.

Anotar la fecha en la que se abrió o se descongeló el frasco, no solo la caducidad impresa en la etiqueta. La mayoría de los problemas con reactivos son problemas de tiempo en uso.

El IPTG es un ejemplo práctico útil, porque se conserva de forma distinta a casi todo lo demás de esta página y la diferencia importa. El isopropil beta-D-1-tiogalactopiranósido tiene una masa molecular de 238,30, de modo que una disolución madre 1 M es de 238,3 g/L; en la práctica, 2,38 g disueltos en agua y enrasados a 10 mL. Se disuelve rápidamente en agua y no necesita calentamiento.

1. Disolver en agua de grado cultivo celular o desionizada y enrasar al volumen final.
2. Esterilizar por filtración a través de una membrana de 0,22 micras. Nunca autoclavar el IPTG: el calor lo degrada.
3. Alicuotar en volúmenes pequeños de un solo uso, normalmente de 0,5 o 1,0 mL.
4. Conservar a -20 grados C, condición en la que la disolución madre se mantiene hasta un año. Evitar la congelación-descongelación repetida; para eso están las alícuotas pequeñas.

Las concentraciones de trabajo son típicamente de 0,1-1 mM. Añadir 1 mL de una disolución madre 1 M a un cultivo de 1 L da una concentración final de 1 mM. Para el cribado azul-blanco, una disolución madre 100 mM es la concentración más cómoda. La idea general va más allá del IPTG: para cualquier disolución madre de una molécula pequeña conviene comprobar si lo que la degrada es el calor, la luz o la congelación-descongelación, y conservarla en consecuencia en lugar de meterlo todo por defecto en la nevera.

Osmolalidad. Las células de mamífero toleran aproximadamente 260-320 mOsmol/kg, y las decisiones sobre el tampón desplazan esa cifra. Añadir HEPES a un medio completo eleva la osmolalidad, porque una disolución madre 1 M está mucho más concentrada que el medio que la recibe; los medios formulados con HEPES lo compensan reduciendo el cloruro de sodio, y los medios que uno suplementa por su cuenta no. La alimentación repetida con suplementos concentrados a lo largo de un cultivo prolongado en lote alimentado acumula osmolalidad de forma sostenida. La adición de base para contrarrestar la acidificación por lactato aporta sodio. Ninguno de estos factores es grande por separado; juntos, a lo largo de un proceso de dos semanas, sí lo son. Si la viabilidad cae en la fase final de un cultivo que nutricionalmente parece adecuado, hay que medir la osmolalidad antes de buscar nada más exótico.

Una secuencia diagnóstica breve para los problemas de pH:

1. El medio permanece púrpura o rosa y nunca amarillea, ni siquiera en un cultivo denso. Desajuste bicarbonato/CO2, casi siempre una formulación de 3,7 g/L funcionando en un incubador al 5 % de CO2. Hay que contrastar la especificación del medio con el ajuste del incubador. Conviene comprobar también que no se haya agotado el suministro de CO2 del incubador y que su sensor esté calibrado.
2. El medio amarillea en el día siguiente a la alimentación. O el cultivo está demasiado denso y debería subcultivarse, o está contaminado. La contaminación bacteriana acidifica deprisa y suele acompañarse de turbidez.
3. El medio amarillea solo en los pocillos exteriores de una placa. Evaporación que concentra el medio. Hay que usar un incubador humidificado y plantear un diseño de placa que sacrifique los pocillos perimetrales.
4. El pH deriva hacia la alcalinidad durante un procedimiento en la mesa de trabajo. Es el comportamiento normal de un medio tamponado solo con bicarbonato. Añadir 10-25 mM de HEPES para ese paso, o usar una formulación con HEPES.
5. El pH es correcto a temperatura ambiente pero no a 37 grados C. El pKa del tampón depende de la temperatura; el HEPES se desplaza unas -0,014 unidades de pH por grado C. Hay que titular y verificar a la temperatura de trabajo.
6. El pH es correcto pero las células parecen estresadas. Medir la osmolalidad. El pH y la osmolalidad son especificaciones independientes y un medio puede ser correcto en una y erróneo en la otra.