Referenzbibliothek Zellkultur
Was jedes Medium, jeder Puffer und jedes Reagenz wirklich ist: Zusammensetzung, Einsatzzweck und der Unterschied zu den Alternativen. Geschrieben für die Laborbank, nicht für einen Prospekt.
Media and formulations
Chemisch definiertes Medium
Ein chemisch definiertes Medium ist ein Zellkulturmedium, bei dem Identität und Konzentration jedes einzelnen Bestandteils bekannt sind — kein Serum, keine Proteinhydrolysate, keine undefinierten Extrakte. Es darf dennoch Proteine enthalten, sofern diese rekombinant sind und in bekannter Sequenz und Konzentration vorliegen; genau deshalb sind chemisch definiert und proteinfrei zwei verschiedene Kategorien und keine Synonyme. Chemisch definierte Medien beseitigen die Chargenschwankungen, das Fremdagenzien-Risiko und den regulatorischen Aufwand des Serums und sind der Standard für die biopharmazeutische Produktion in CHO-, HEK293- und Hybridomsystemen.
→RPMI 1640 Medium
RPMI 1640 ist ein Basalmedium für die Zellkultur, das 1966 am Roswell Park Memorial Institute für die Kultur humaner Leukozyten in Suspension entwickelt wurde. Es enthält 2000 mg/L Glucose (11.1 mM), 2000 mg/L Natriumhydrogencarbonat (23.8 mM) als Puffer für eine Atmosphäre mit 5% CO2, ungewöhnlich viel Phosphat (etwa 5.6 mM), wenig Calcium (etwa 0.42 mM) sowie ein charakteristisches Bestandteilsspektrum mit reduziertem Glutathion, Biotin, Vitamin B12, para-Aminobenzoesäure und Hydroxyprolin. Es ist das Standardmedium für Lymphozyten, Hybridome und die meisten suspensionsadaptierten hämatopoetischen und lymphoiden Zelllinien und wird üblicherweise mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt.
→MEM Alpha (α-MEM) und Minimum Essential Medium
MEM Alpha (α-MEM) ist Eagles Minimum Essential Medium, angereichert mit allen nichtessenziellen Aminosäuren, Natriumpyruvat, Liponsäure, Ascorbinsäure, Biotin und Vitamin B12, und wird wahlweise mit oder ohne Ribonukleoside und Desoxyribonukleoside geliefert. Es nutzt dieselbe Salzbasis wie MEM — 2200 mg/L Natriumhydrogencarbonat, abgestimmt auf eine Atmosphäre mit 5% CO2, 1000 mg/L Glucose und 1.8 mM Calcium — und ist das Standardmedium für mesenchymale Stromazellen, Knochenmarkkulturen, Osteoblasten, die Selektion von CHO-DXB11 und CHO-DG44 sowie viele Primärzelltypen. Für Selektionssysteme mit HAT und Methotrexat wird die nukleosidfreie Variante benötigt.
→DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) ist ein Basalmedium für die Zellkultur, das aus Eagles Minimal Essential Medium hervorging, indem die Aminosäure- und Vitaminkonzentrationen etwa vervierfacht wurden. Es wird glucosereich (4500 mg/L, 25 mM) und glucosearm (1000 mg/L, 5.6 mM) geliefert, ist mit 3700 mg/L Natriumhydrogencarbonat gepuffert und benötigt Serum oder einen definierten Zusatz sowie eine CO2-Atmosphäre, um den physiologischen pH-Wert zu halten. DMEM ist das Standardmedium für adhärente Linien wie HEK293, HeLa, NIH/3T3, Vero und adhärente CHO-Kulturen sowie für die meisten primären Fibroblasten.
→Phenolrot im Zellkulturmedium
Phenolrot (Phenolsulfonphthalein) ist ein pH-Indikator, der Zellkulturmedien in etwa 5-15 mg/L zugesetzt wird; unterhalb von etwa pH 6.8 schlägt er nach Gelb um, oberhalb von etwa pH 8.2 nach Rosa bis Fuchsia, während das normale Rot-Orange eines gesunden Mediums nahe pH 7.4 liegt. Wird das Medium gelb, ist es sauer geworden — fast immer durch Lactat aus dem Zellstoffwechsel, aus einer überwachsenen Kultur oder aus bakterieller Kontamination. Wird es rosa oder violett, ist es alkalisch geworden, nahezu immer weil CO2 aus dem Bicarbonatpuffer entwichen ist. Phenolrot puffert selbst nicht und ist rein diagnostisch; verwenden Sie phenolrotfreies Medium für Fluoreszenz- und Absorptionstests sowie für Arbeiten an östrogenempfindlichen Zellen, wo der Farbstoff die Messung stört.
→Reagents and buffers
HEPES-Puffer in der Zellkultur
HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure) ist ein zwitterionischer organischer Puffer, der in der Zellkultur das Medium im physiologischen pH-Bereich hält, ohne auf das CO2 des Inkubators angewiesen zu sein. Sein pKa liegt bei etwa 7.5 bei 20-25 °C und bei etwa 7.3 bei 37 °C, woraus sich eine nutzbare Pufferwirkung über rund pH 6.8-8.2 ergibt; üblicherweise wird er dem Medium in 10-25 mM aus einer sterilen 1 M Stammlösung zugesetzt. Da die Pufferwirkung von HEPES nicht auf dem Gleichgewicht aus Kohlensäure und Bicarbonat beruht, widersteht ein mit HEPES ergänztes Medium der schnellen Drift ins Alkalische, die auftritt, sobald ein Kulturkolben den Inkubator mit 5% CO2 verlässt.
→HBSS (Hanks' ausgewogene Salzlösung)
HBSS (Hanks' ausgewogene Salzlösung) ist eine isotone ausgewogene Salzlösung zum Waschen von Zellen, zum Transport von Gewebe, zum Verdünnen von Reagenzien und zum kurzzeitigen Halten von Zellen außerhalb ihres Wachstumsmediums. Sie enthält 8.0 g/L Natriumchlorid, 1.0 g/L D-Glucose, Phosphat und 350 mg/L Natriumbicarbonat und wird entweder mit Calcium und Magnesium (1.26 mM Ca, ~0.9 mM Mg gesamt) oder ohne diese geliefert. Der niedrige Bicarbonatgehalt bedeutet, dass HBSS für den Einsatz bei atmosphärischem CO2 oder in verschlossenen Gefäßen ausgelegt ist, nicht für längere Kultur im 5% CO2-Inkubator.
→Trypanblau und der Farbstoffausschlusstest zur Viabilitätsbestimmung
Trypanblau ist ein Diazofarbstoff, der als 0.4% (w/v) Lösung eingesetzt wird, um lebende von toten Zellen über den Farbstoffausschluss zu unterscheiden: Eine intakte Plasmamembran hält den geladenen Farbstoff draußen, sodass lebensfähige Zellen klar und lichtbrechend bleiben, während Zellen mit geschädigter Membran den Farbstoff aufnehmen und sich blau anfärben. In der Praxis wird die Zellsuspension 1:1 mit 0.4% Trypanblau gemischt, in eine Zählkammer oder ein automatisches Zellzählgerät gegeben und innerhalb von 3-5 Minuten ausgezählt, was gleichzeitig eine Zellkonzentration und eine prozentuale Viabilität liefert. Da nur die Membranintegrität erfasst wird, zählt Trypanblau Zellen, die bereits gestorben sind — apoptotische oder metabolisch versagende Zellen mit noch intakter Membran erkennt es nicht, sodass die Werte im Vergleich zu metabolischen oder durchflusszytometrischen Viabilitätstests zu hoch ausfallen.
→ACK-Lysepuffer
Der ACK-Lysepuffer (Ammonium-Chloride-Potassium) ist eine isotone Ammoniumchloridlösung, mit der Erythrozyten aus Leukozytenpräparationen wie Mausmilz, Knochenmark und Buffy Coat entfernt werden. Die Standardzusammensetzung besteht aus 150 mM Ammoniumchlorid (8.02 g/L NH4Cl), 10 mM Kaliumbicarbonat (1.0 g/L KHCO3) und 0.1 mM Dinatrium-EDTA, eingestellt auf pH 7.2-7.4. Erythrozyten lysieren bei Raumtemperatur innerhalb von einer bis fünf Minuten osmotisch, weil ihr Bande-3-Anionenaustauscher und ihre hohe Carboanhydrase-Aktivität Ammoniumchlorid und Wasser in die Zelle treiben, während Leukozyten, denen diese Transportkapazität fehlt, überleben.
→Trypsin-EDTA
Trypsin-EDTA ist ein Reagenz zur Zelldissoziation, das die Serinprotease Trypsin — sie spaltet Peptidbindungen C-terminal von Lysin- und Argininresten in Zelloberflächen- und Matrixproteinen — mit dem Komplexbildner EDTA kombiniert, der die von Zelladhäsionsmolekülen benötigten Calcium- und Magnesiumionen bindet. Geliefert wird es in einer Calcium- und Magnesium-freien ausgewogenen Salzlösung, meist mit 0.05% Trypsin (0.5 g/L) für gängige Zelllinien und 0.25% (2.5 g/L) für fest anhaftende Zellen und Primärkulturen. Üblich sind 2-5 Minuten bei 37 °C, gefolgt von der sofortigen Neutralisation mit serumhaltigem Medium oder einem definierten Trypsininhibitor.
→Puromycin zur Selektion von Säugerzellen
Puromycin ist ein Aminonukleosid-Antibiotikum aus Streptomyces alboniger, das das Aminoacyl-Ende der tRNA nachahmt, in die A-Stelle des Ribosoms eintritt und die vorzeitige Freisetzung einer verkürzten Peptidkette auslöst, wodurch Zellen absterben, die es nicht inaktivieren können. In der Säugerzellkultur dient es als Selektionsantibiotikum bei 0.5-10 ug/mL, am häufigsten bei 1-2 ug/mL, und es tötet nicht resistente Zellen schneller ab als jedes andere gebräuchliche Selektionsantibiotikum — typischerweise innerhalb von 2-5 Tagen. Die Resistenz vermittelt das pac-Gen, das für die Puromycin-N-Acetyltransferase codiert; diese acetyliert den Wirkstoff und macht ihn unwirksam. Da die wirksame Konzentration stark von Zelllinie, Zelldichte und Serumgehalt abhängt, muss für jede neue Zelllinie und jede neue Puromycin-Charge eine Abtötungskurve erstellt werden.
→Penicillin-Streptomycin und Antibiotikum-Antimykotikum in der Zellkultur
Penicillin-Streptomycin, allgemein zu Pen-Strep verkürzt, wird als sterile 100X-Lösung mit 10000 Einheiten/mL Penicillin G und 10000 ug/mL Streptomycin geliefert; 1:100 ins Medium verdünnt ergibt das eine Arbeitskonzentration von 100 U/mL Penicillin und 100 ug/mL Streptomycin. Penicillin blockiert die bakterielle Zellwandsynthese und deckt vor allem grampositive Keime ab, Streptomycin bindet an die ribosomale 30S-Untereinheit der Bakterien und deckt vor allem gramnegative ab -- zusammen ergibt das ein breites antibakterielles Spektrum. Antibiotikum-Antimykotikum (Anti-Anti) ist dieselbe Kombination plus 25 ug/mL Amphotericin B im 100X-Konzentrat, also 0.25 ug/mL im Einsatz, und ergänzt die Wirkung gegen Pilze. Gegen Mykoplasmen wirkt keines von beiden, und die großen Zellbanken einschließlich ATCC raten vom routinemäßigen Antibiotikazusatz ab, weil er eine schwache Kontamination verdeckt statt sie zu verhindern.
→Rinderserum in der Zellkultur
Rinderserum ist der flüssige Anteil geronnenen Rinderbluts und wird dem Nährmedium mit 5-10 % zugesetzt, um Wachstumsfaktoren, Hormone, Transport- und Anheftungsproteine, Lipide und Spurenelemente zu liefern, die Basalmedien nicht enthalten. Fötales Rinderserum (FBS) und fötales Kälberserum (FCS) sind zwei Namen für dasselbe Produkt, das beim Schlachten trächtiger Kühe vom Fötus gewonnen wird; Neugeborenen-Kälberserum stammt von Kälbern unter etwa 20 Tagen und Spenderrinderserum aus kontrollierten Spenderherden im Alter von rund 12-36 Monaten -- beide enthalten mehr Immunglobulin und weniger Wachstumsfaktoren als FBS. Weil Serum ein undefiniertes biologisches Material mit erheblichen Chargenschwankungen, ungeklärten Tierschutzfragen und einer schwankenden Lieferkette ist, werden definierte serumfreie und von tierischen Bestandteilen freie Medien überall dort zunehmend bevorzugt, wo die Zelllinie sie verträgt.
→Glucoselösung in der Zellkultur
Eine Glucoselösung für die Zellkultur ist eine konzentrierte sterile D-Glucose-Stammlösung, üblicherweise mit 300-450 g/L (30-45% w/v), die zur Ergänzung von Basalmedien und zur Zufütterung von Kulturen dient, die Glucose schneller verbrauchen, als das Medium sie bereitstellt. D-Glucose hat eine Molmasse von 180.16, daher entspricht 1 g/L genau 5.55 mM: Standardmedien reichen von 1 g/L (5.5 mM) in DMEM mit niedrigem Glucosegehalt über 2 g/L (11.1 mM) in RPMI 1640 bis zu 4.5 g/L (25 mM) in DMEM mit hohem Glucosegehalt. Glucose wird zugegeben, um eine Erschöpfung in langen oder dichten Kulturen zu verhindern, und sie wird in der Regel sterilfiltriert statt autoklaviert, weil das Erhitzen von Glucose mit Aminosäuren Bräunungsprodukte erzeugt.
→Puffer in der Zellkultur
Zellkulturpuffer halten das Medium in dem Bereich von pH 7.2-7.4, den Säugerzellen benötigen, und zwar gegen die Säurelast, die die Zellen beim Stoffwechsel erzeugen. Das Standardsystem nahezu jedes klassischen Mediums ist Natriumbicarbonat im Zusammenspiel mit dem CO2 der Inkubatoratmosphäre; deshalb muss der Bicarbonatgehalt zur Einstellung des Inkubators passen: etwa 1.5-2.2 g/L NaHCO3 bei 5% CO2 und 3.7 g/L bei 10% CO2. Organische Puffer wie HEPES (pKa 7.48) werden mit 10-25 mM zugesetzt, um den pH-Wert außerhalb einer CO2-Atmosphäre zu halten, während phosphatgepufferte Lösungen wie PBS und DPBS zum Waschen und für kurze Handhabungsschritte dienen, nicht zum Wachstum.
→Dispase
Dispase, auch als Dispase II oder neutrale Protease angeboten, ist eine zinkabhängige Metalloprotease aus Paenibacillus (früher Bacillus) polymyxa, EC 3.4.24.4, die zur schonenden Zelldissoziation und zum intakten Ablösen von Zellen und Epithelverbänden dient. Sie spaltet Fibronektin und Kollagen Typ IV, baut Kollagen Typ I nur minimal ab und greift Laminin und Kollagen Typ V nicht an – deshalb lässt sich mit ihr eine Epidermis von der Dermis trennen oder ein konfluenter Epithelverband vom Kunststoff abheben, ohne die Zell-Zell-Verbindungen zu zerstören. Da sie als Metalloprotease Zink für die Katalyse und Calcium für die Stabilität braucht, wird sie durch EDTA, EGTA und 1,10-Phenanthrolin gehemmt und muss in einem calciumhaltigen Puffer verdünnt werden, nicht in einem Puffer mit Chelatbildnern.
→Rekombinantes Humaninsulin in der Zellkultur
Rekombinantes Humaninsulin ist ein zweikettiges Protein aus 51 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 5.8 kDa und dient als Kernsupplement in serumfreien und chemisch definierten Kulturmedien, wo es die Aufnahme von Glukose und Aminosäuren, die Protein- und Lipidsynthese sowie das Zellüberleben antreibt. Es wird in *E. coli* oder Hefe hergestellt statt aus tierischem Pankreas gewonnen, ist damit frei von tierischen Bestandteilen und wird meist als zinkstabilisiertes Trockenpulver geliefert. Die übliche Arbeitskonzentration beträgt 5–10 µg/mL – der Wert, den ein 1X-ITS-Supplement liefert – und liegt damit rund tausendfach über dem physiologischen Insulinspiegel; bei dieser Konzentration wirkt Insulin wesentlich auch über den IGF-1-Rezeptor. Da Insulin nahe dem neutralen pH-Wert schlecht löslich ist, muss das Pulver vor der Verdünnung im Medium in verdünnter Salzsäure oder Essigsäure gelöst werden.
→Sera, supplements and cell lines
Sf9-Zellen und das Baculovirus-Expressionssystem
Sf9 ist eine klonale Insektenzelllinie, die aus Sf21 isoliert wurde; Sf21 wiederum wurde aus dem Ovarialgewebe von Puppen des Herbst-Heerwurms *Spodoptera frugiperda* etabliert. Sf9 ist der Standardwirt für das Baculovirus-Expressionsvektorsystem und dient der Herstellung rekombinanter Proteine, virusähnlicher Partikel und von AAV. Sf9-Zellen wachsen bei 27 C ohne CO2 in phosphatgepufferten Insektenmedien bei pH 6.2-6.4, passen sich bereitwillig an die serumfreie Suspensionskultur bei 100-130 rpm an und verdoppeln sich alle 18-24 Stunden. Kulturen werden bei etwa 2.5-3.5 x 10^6 Zellen/mL passagiert und auf rund 1 x 10^6 Zellen/mL zurückverdünnt; infiziert wird an gesunden Zellen in der log-Phase mit einer Lebensfähigkeit über 95 %.
→DF-1 Hühnerembryo-Fibroblastenzellen
DF-1 (UMNSAH/DF-1, ATCC CRL-12203) ist eine spontan immortalisierte Hühnerembryo-Fibroblastenlinie, die aus Embryonen der East Lansing Line 0 stammt -- einer Hühnerlinie ohne endogene Loci des aviären Leukosevirus. Da sie kein endogenes Retrovirus trägt und ohne virale oder chemische Transformation immortalisiert wurde, ist sie der etablierte kontinuierliche Ersatz für primäre Hühnerembryo-Fibroblasten in der aviären Virologie, der Impfstoffentwicklung und der Herstellung rekombinanter Viren. DF-1-Zellen werden in DMEM mit hohem Glucosegehalt und 10% fetalem Kälberserum bei 37 °C und 5% CO2 kultiviert, wachsen schneller als primäre CEF, lassen sich effizient transfizieren und unterstützen die Replikation von aviärer Influenza, dem Virus der infektiösen Bursitis, aviären Leukose- und Sarkomviren sowie vielen weiteren aviären Erregern mit Titern, die denen auf CEF entsprechen oder darüber liegen.
→Protocols and methods
Zellzählung mit der Zählkammer
Eine Zählkammer ist ein dicker Glasobjektträger mit präzise eingeätztem Gitter, über dem ein Deckglas eine genau 0.1 mm tiefe Kammer bildet, sodass sich ein bekanntes Volumen einer Zellsuspension unter dem Mikroskop auszählen und in eine Konzentration umrechnen lässt. Bei Säugerzellen zählt man die vier Eckquadrate von je 1 mm2, bildet den Mittelwert, multipliziert mit dem Verdünnungsfaktor und mit 10^4 und erhält so Zellen pro mL — denn jedes Eckquadrat umschließt genau 10^-4 mL. Mischt man die Probe vor dem Befüllen 1:1 mit 0.4% Trypanblau, liefert dieselbe Zählung zugleich den Viabilitätsanteil, da nur tote Zellen mit geschädigter Membran den Farbstoff aufnehmen.
→Hitzeinaktivierung von fötalem Rinderserum (FBS)
Die Hitzeinaktivierung von fötalem Rinderserum ist eine kontrollierte Inkubation von 30 Minuten bei 56 °C, die die hitzelabilen Proteine der Komplementkaskade zerstört, bevor das Serum dem Nährmedium zugesetzt wird. Das Serum wird aufgetaut, auf 37 °C gebracht, in ein Wasserbad mit 56 °C überführt, ab dem Moment, in dem das Serum selbst die Temperatur erreicht, genau 30 Minuten gehalten -- unter vorsichtigem Schwenken alle 5-10 Minuten --, danach sofort gekühlt und portioniert. Für die Routinekultur etablierter Zelllinien ist der Schritt meist unnötig, weil die Komplementaktivität in fötalem Serum niedrig ist und das Erhitzen zugleich labile Wachstumsfaktoren abbaut; für immunologische Untersuchungen und komplementempfindliche Zellen bleibt er gängige Praxis.
→Subkultivierung von Zellen (Passagieren)
Die Subkultivierung von Zellen, auch Passagieren genannt, ist die Überführung von Zellen aus einer Kultur, die sich der Konfluenz nähert, in frische Gefäße mit frischem Medium, damit das Wachstum weitergehen kann. Adhärente Zellen werden zuerst abgelöst, meist mit 0.25% oder 0.05% Trypsin-EDTA oder einem nicht enzymatischen Dissoziationsreagenz, und dann in geringerer Dichte neu ausgesät, festgelegt durch ein Teilungsverhältnis wie 1:4; Suspensionszellen werden ohne jeden Dissoziationsschritt einfach in frisches Medium verdünnt. Die meisten kontinuierlichen adhärenten Zelllinien werden bei 70-80% Konfluenz subkultiviert, was in der Regel zwei bis drei Passagen pro Woche bedeutet.
→Einfriermedium für Zellen und Protokolle zur Kryokonservierung
Ein Einfriermedium für Zellen ist eine Lösung mit Kryoprotektivum, die Zellen das Einfrieren und die Langzeitlagerung überstehen lässt; am häufigsten besteht es aus einem Basalmedium oder Serum mit 5-10% Dimethylsulfoxid (DMSO), wobei 10% der Standardausgangspunkt ist. DMSO dringt in die Zelle ein und verändert, wie Wasser gefriert; so werden die intrazellulären Eiskristalle verhindert, die sonst beim Abkühlen die Membranen zerreißen. Zellen werden mit einer definierten Abkühlrate von etwa 1 C pro Minute auf -80 C gebracht und anschließend in die Gasphase über flüssigem Stickstoff überführt, denn die Langzeitlagerung erfordert Temperaturen unterhalb von etwa -135 C, damit Eis nicht rekristallisiert. Das Auftauen verläuft umgekehrt - so schnell wie möglich im 37-C-Wasserbad, gefolgt von zügigem Verdünnen, um das DMSO zu entfernen, das oberhalb des Gefrierpunkts für Zellen toxisch ist.
→Comparisons
PBS und DPBS: Was sich unterscheidet und welche Lösung Sie brauchen
PBS und DPBS sind beide phosphatgepufferte Kochsalzlösungen; der Unterschied liegt in der Rezeptur, nicht in der Funktion. Dulbeccos Formulierung (DPBS) enthält zusätzlich Kaliumchlorid und rund doppelt so viel Phosphat wie ein typisches PBS (etwa 9.5 mM gegenüber etwa 4 mM), und sie wird in zwei Varianten verkauft — mit Calcium und Magnesium sowie ohne. In der Praxis zählt die Entscheidung mit oder ohne zweiwertige Kationen weit mehr als die Aufschrift PBS oder DPBS: Verwenden Sie eine calcium- und magnesiumfreie Lösung, um Zellen vor der Trypsinierung oder der Ablösung mit EDTA zu waschen, denn Ca2+ und Mg2+ stützen genau die Cadherin- und Integrinbindungen, die Sie gleich lösen wollen; und verwenden Sie die Variante mit Calcium und Magnesium, wenn die Zellen den Waschschritt angeheftet und unversehrt überstehen sollen.
→Essenzielle und nicht essenzielle Aminosäuren in der Zellkultur
In der Zellkultur heißt eine Aminosäure essenziell, wenn kultivierte Säugerzellen sie nicht in ausreichender Menge selbst bilden können und sie deshalb im Medium vorliegen muss -- dreizehn davon, die von Harry Eagle bestimmte Gruppe, darunter Arginin, Cystin, Tyrosin und Glutamin, die ernährungsphysiologisch nicht als essenziell gelten. Die sieben nicht essenziellen Aminosäuren -- Glycin, Alanin, Asparagin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Prolin und Serin -- können von den meisten Zellen synthetisiert werden und werden dennoch zugesetzt, weil ihre Herstellung Kohlenstoff, ATP und Reduktionsäquivalente verbraucht, die sonst in das Wachstum fließen würden. Ein Supplement MEM NEAA 100X enthält alle sieben zu je 10 mM und liefert damit in Arbeitsstärke je 0.1 mM; geben Sie es zu MEM oder DMEM, die wenige oder keine enthalten, und lassen Sie es bei Ham's F-12, IMDM und DMEM/F-12 weg, die bereits alle sieben mitbringen.
→EMEM vs. DMEM: Was die Modifikation tatsächlich verändert hat
EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium, auch als MEM verkauft) und DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) sind dasselbe Medium eine Generation auseinander: DMEM ist die angereicherte Formulierung von Eagle — mit rund viermal so viel Vitaminen, etwa doppelt so viel der meisten Aminosäuren, doppeltem L-Glutamin, zusätzlichem Glycin und Serin, Eisen(III)-nitrat und 3.7 g/L Natriumbicarbonat gegenüber 1.5-2.2 g/L bei EMEM. Praktisch bedeutet das: DMEM trägt schnell wachsende, stoffwechselaktive Linien wie HEK293 und NIH/3T3, während EMEM zu langsameren, weniger anspruchsvollen adhärenten Zellen und Primärlinien passt. Und weil das höhere Natriumbicarbonat in DMEM auf 10 % CO2 ausgelegt ist und das von EMEM auf 5 %, sind beide nicht austauschbar, ohne den Inkubator zu prüfen.
→Trypsin vs. Accutase: Das richtige Zelldissoziationsreagenz wählen
Trypsin ist eine Serinprotease aus dem Pankreas, die Peptidbindungen nach Lysin und Arginin spaltet. Sie löst Zellen schnell, aber unselektiv ab, muss mit Serum oder einem Trypsininhibitor gestoppt werden und spaltet neben den Adhäsionskontakten auch Oberflächenproteine. Accutase ist eine proprietäre Mischung proteolytischer und kollagenolytischer Enzyme aus einer wirbellosen Quelle, geliefert in calcium- und magnesiumfreiem DPBS mit 0.5 mM EDTA; sie wirkt langsamer und schonender, benötigt keinen Neutralisationsschritt und erhält mehr Oberflächenepitope. Wählen Sie Trypsin für das routinemäßige Passagieren robuster adhärenter Linien, wenn es auf Tempo ankommt und die Zellen direkt zurück in Kultur gehen; wählen Sie Accutase, wenn die geernteten Zellen selbst das Experiment sind — Durchflusszytometrie auf Oberflächenmarker, pluripotente Stammzellen, primäre Neurone oder jede Einzelzellsuspension, in der Lebensfähigkeit und Phänotyp die Ernte überstehen müssen.
→Contamination and quality control
Kontamination in der Zellkultur
Kontamination in der Zellkultur lässt sich in sechs Kategorien einteilen: Bakterien, Hefen, Fadenpilze und Schimmel, Mykoplasmen, Viren sowie Kreuzkontamination durch eine andere Zelllinie. Bakterien, Hefen und Pilze melden sich innerhalb von einem bis fünf Tagen durch Trübung, eine pH-Verschiebung oder sichtbare Partikel im Mikroskop; man verwirft die Kultur und sucht den Technikfehler, der sie hineingelassen hat. Mykoplasmen, virale Kontamination und die Fehlidentifikation von Zelllinien verursachen überhaupt keine sichtbare Veränderung und werden nur durch gezielte Testung gefunden — PCR oder DNA-Färbung bei Mykoplasmen, STR-Analyse für die Identität. Die richtige Reaktion auf jede bestätigte biologische Kontamination lautet: betroffene Kultur verwerfen, den Inkubator dekontaminieren und aus einem sauberen kryokonservierten Stock neu starten.
→Endotoxinbestimmung in der Zellkultur
Die Endotoxinbestimmung misst bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) in Laborwasser, Medien, Seren und Reagenzien und gibt das Ergebnis in Endotoxineinheiten pro Milliliter (EU/mL) an, wobei 1 EU etwa 0.1–0.2 ng Referenzstandard-Endotoxin aus E. coli entspricht. Die Arzneibuchverfahren sind der LAL-Test (Limulus-Amöbozyten-Lysat) in den Varianten Gelclot, turbidimetrisch und chromogen nach USP <85> sowie der tierfreie Test mit rekombinantem Faktor C (rFC) nach USP <86>; kinetische Formate quantifizieren bis hinunter zu etwa 0.001–0.005 EU/mL. Praxisübliche Grenzwerte in der Zellkultur sind 0.25 EU/mL für Wasser, ≤1 EU/mL für die meisten Reagenzien in Zellkulturqualität und ≤10 EU/mL als allgemeiner Branchenstandard für fötales Rinderserum, mit endotoxinarmen Qualitäten bei ≤1 EU/mL und besonders endotoxinarmen Qualitäten unter 0.1 EU/mL. Endotoxin übersteht das Autoklavieren und passiert 0.2-µm-Filter, es muss daher an der Quelle ausgeschlossen und kann nicht nachträglich entfernt werden.
→Selektionsantibiotika für Säugerzelllinien
Selektionsantibiotika sind zytotoxische Wirkstoffe, mit denen sich Säugerzellen isolieren lassen, die ein mit eingebrachtes Resistenzgen tragen — indem jede Zelle abgetötet wird, die es nicht trägt. Die fünf Standardmittel sind G418/Geneticin (100–2000 µg/mL, Resistenzgen neo), Hygromycin B (50–1000 µg/mL, hph), Blasticidin S (1–20 µg/mL, bsd oder bsr), Zeocin (50–1000 µg/mL, Sh ble) und Puromycin (0.5–10 µg/mL, pac). Die richtige Konzentration steht nicht auf dem Datenblatt, sondern wird für Ihre Zelllinie empirisch über eine Abtötungskurve bestimmt: die niedrigste Konzentration, die innerhalb des normalen Selektionsfensters des Mittels 100 % der untransfizierten Zellen abtötet — 2–4 Tage bei Puromycin und bis zu 14 Tage bei G418.
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