Referenzbibliothek Zellkultur
Was jedes Medium, jeder Puffer und jedes Reagenz wirklich ist: Zusammensetzung, Einsatzzweck und der Unterschied zu den Alternativen. Geschrieben für die Laborbank, nicht für einen Prospekt.
Media and formulations
Chemisch definiertes Medium
Ein chemisch definiertes Medium ist ein Zellkulturmedium, bei dem Identität und Konzentration jedes einzelnen Bestandteils bekannt sind — kein Serum, keine Proteinhydrolysate, keine undefinierten Extrakte. Es darf dennoch Proteine enthalten, sofern diese rekombinant sind und in bekannter Sequenz und Konzentration vorliegen; genau deshalb sind chemisch definiert und proteinfrei zwei verschiedene Kategorien und keine Synonyme. Chemisch definierte Medien beseitigen die Chargenschwankungen, das Fremdagenzien-Risiko und den regulatorischen Aufwand des Serums und sind der Standard für die biopharmazeutische Produktion in CHO-, HEK293- und Hybridomsystemen.
→RPMI 1640 Medium
RPMI 1640 ist ein Basalmedium für die Zellkultur, das 1966 am Roswell Park Memorial Institute für die Kultur humaner Leukozyten in Suspension entwickelt wurde. Es enthält 2000 mg/L Glucose (11.1 mM), 2000 mg/L Natriumhydrogencarbonat (23.8 mM) als Puffer für eine Atmosphäre mit 5% CO2, ungewöhnlich viel Phosphat (etwa 5.6 mM), wenig Calcium (etwa 0.42 mM) sowie ein charakteristisches Bestandteilsspektrum mit reduziertem Glutathion, Biotin, Vitamin B12, para-Aminobenzoesäure und Hydroxyprolin. Es ist das Standardmedium für Lymphozyten, Hybridome und die meisten suspensionsadaptierten hämatopoetischen und lymphoiden Zelllinien und wird üblicherweise mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt.
→Reagents and buffers
HBSS (Hanks' ausgewogene Salzlösung)
HBSS (Hanks' ausgewogene Salzlösung) ist eine isotone ausgewogene Salzlösung zum Waschen von Zellen, zum Transport von Gewebe, zum Verdünnen von Reagenzien und zum kurzzeitigen Halten von Zellen außerhalb ihres Wachstumsmediums. Sie enthält 8.0 g/L Natriumchlorid, 1.0 g/L D-Glucose, Phosphat und 350 mg/L Natriumbicarbonat und wird entweder mit Calcium und Magnesium (1.26 mM Ca, ~0.9 mM Mg gesamt) oder ohne diese geliefert. Der niedrige Bicarbonatgehalt bedeutet, dass HBSS für den Einsatz bei atmosphärischem CO2 oder in verschlossenen Gefäßen ausgelegt ist, nicht für längere Kultur im 5% CO2-Inkubator.
→Trypanblau und der Farbstoffausschlusstest zur Viabilitätsbestimmung
Trypanblau ist ein Diazofarbstoff, der als 0.4% (w/v) Lösung eingesetzt wird, um lebende von toten Zellen über den Farbstoffausschluss zu unterscheiden: Eine intakte Plasmamembran hält den geladenen Farbstoff draußen, sodass lebensfähige Zellen klar und lichtbrechend bleiben, während Zellen mit geschädigter Membran den Farbstoff aufnehmen und sich blau anfärben. In der Praxis wird die Zellsuspension 1:1 mit 0.4% Trypanblau gemischt, in eine Zählkammer oder ein automatisches Zellzählgerät gegeben und innerhalb von 3-5 Minuten ausgezählt, was gleichzeitig eine Zellkonzentration und eine prozentuale Viabilität liefert. Da nur die Membranintegrität erfasst wird, zählt Trypanblau Zellen, die bereits gestorben sind — apoptotische oder metabolisch versagende Zellen mit noch intakter Membran erkennt es nicht, sodass die Werte im Vergleich zu metabolischen oder durchflusszytometrischen Viabilitätstests zu hoch ausfallen.
→Contamination and quality control
Kontamination in der Zellkultur
Kontamination in der Zellkultur lässt sich in sechs Kategorien einteilen: Bakterien, Hefen, Fadenpilze und Schimmel, Mykoplasmen, Viren sowie Kreuzkontamination durch eine andere Zelllinie. Bakterien, Hefen und Pilze melden sich innerhalb von einem bis fünf Tagen durch Trübung, eine pH-Verschiebung oder sichtbare Partikel im Mikroskop; man verwirft die Kultur und sucht den Technikfehler, der sie hineingelassen hat. Mykoplasmen, virale Kontamination und die Fehlidentifikation von Zelllinien verursachen überhaupt keine sichtbare Veränderung und werden nur durch gezielte Testung gefunden — PCR oder DNA-Färbung bei Mykoplasmen, STR-Analyse für die Identität. Die richtige Reaktion auf jede bestätigte biologische Kontamination lautet: betroffene Kultur verwerfen, den Inkubator dekontaminieren und aus einem sauberen kryokonservierten Stock neu starten.
→Endotoxinbestimmung in der Zellkultur
Die Endotoxinbestimmung misst bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) in Laborwasser, Medien, Seren und Reagenzien und gibt das Ergebnis in Endotoxineinheiten pro Milliliter (EU/mL) an, wobei 1 EU etwa 0.1–0.2 ng Referenzstandard-Endotoxin aus E. coli entspricht. Die Arzneibuchverfahren sind der LAL-Test (Limulus-Amöbozyten-Lysat) in den Varianten Gelclot, turbidimetrisch und chromogen nach USP <85> sowie der tierfreie Test mit rekombinantem Faktor C (rFC) nach USP <86>; kinetische Formate quantifizieren bis hinunter zu etwa 0.001–0.005 EU/mL. Praxisübliche Grenzwerte in der Zellkultur sind 0.25 EU/mL für Wasser, ≤1 EU/mL für die meisten Reagenzien in Zellkulturqualität und ≤10 EU/mL als allgemeiner Branchenstandard für fötales Rinderserum, mit endotoxinarmen Qualitäten bei ≤1 EU/mL und besonders endotoxinarmen Qualitäten unter 0.1 EU/mL. Endotoxin übersteht das Autoklavieren und passiert 0.2-µm-Filter, es muss daher an der Quelle ausgeschlossen und kann nicht nachträglich entfernt werden.
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