Glucoselösung in der Zellkultur

D-Glucose (Dextrose) hat eine Molmasse von 180.16 g/mol. Die Umrechnung, die jeder Berechnung auf dieser Seite zugrunde liegt, lautet daher:

1 g/L D-Glucose = 5.55 mM und 1 mM = 0.180 g/L.

Konzentrierte Stammlösungen werden in mehreren Stärken angeboten und angesetzt. Die Prozentangaben verstehen sich als Gewicht pro Volumen:

Ein Rechenbeispiel: Um eine 1-L-Flasche DMEM mit niedrigem Glucosegehalt (1 g/L) auf den Wert von DMEM mit hohem Glucosegehalt (4.5 g/L) zu bringen, müssen 3.5 g/L zugegeben werden, also 11.7 mL einer Stammlösung mit 300 g/L oder 8.75 mL einer Stammlösung mit 400 g/L.

Die Osmolalität ist die Größe, die begrenzt, wie viel zugegeben werden darf. Glucose ist ein Nichtelektrolyt, jedes Mol trägt also etwa ein Osmol bei - eine Stammlösung mit 300 g/L liegt in der Größenordnung von 1700 mOsmol/kg. Die Zugabe von 10 mL dieser Stammlösung zu einem Liter Medium hebt die Osmolalität um rund 17 mOsmol/kg an. Eine einzelne Zugabe fällt gegenüber einem Medium bei 260-320 mOsmol/kg nicht ins Gewicht. Zehn Zufütterungen über einen zweiwöchigen Fed-Batch-Lauf schon, und die schleichend steigende Osmolalität durch wiederholtes Zufüttern ist eine reale und häufig übersehene Ursache für nachlassende Viabilität im späten Kulturverlauf. Wenn Sie wiederholt zufüttern, verwenden Sie entweder die höchstkonzentrierte verfügbare Stammlösung, damit das zugegebene Volumen möglichst klein bleibt, oder verfolgen Sie die Osmolalität parallel zur Glucose.

Basalmedien unterscheiden sich stark im Glucosegehalt, und dieser Unterschied ist beabsichtigt und nicht willkürlich. Der Blutzucker des Menschen liegt bei etwa 5.5 mM, eine Formulierung mit niedrigem Glucosegehalt ist also die physiologische, und ein hoher Glucosegehalt liegt rund vier- bis fünfmal über dem physiologischen Wert.

Ein hoher Glucosegehalt fördert schnellere Proliferation und erlaubt längere Abstände zwischen den Fütterungen, allerdings auf Kosten von mehr Lactat: Zellen mit aerober Glykolyse wandeln Glucose in Lactat um, statt sie vollständig zu oxidieren, und das Lactat säuert das Medium an. Ein niedriger Glucosegehalt begrenzt diese Lactatlast und liegt näher am physiologischen Stoffwechsel, erfordert dafür aber früher Aufmerksamkeit.

Glucosefreie Formulierungen gibt es aus einem bestimmten und zunehmend häufigen Grund: Ersetzt man Glucose durch Galactose, sind die Zellen auf die oxidative Phosphorylierung statt auf die Glykolyse angewiesen - die Standardmanipulation zur Untersuchung der Mitochondrienfunktion und zur Sensibilisierung von Zellen in Stoffwechselassays. Glucosefreie Medien sind außerdem der Ausgangspunkt für definierte Fütterungsstudien, in denen die Glucose die untersuchte Variable ist.

Ein Basalmedium ist so formuliert, dass es eine Kultur vom Aussäen bis zur nächsten geplanten Fütterung trägt. Eine Ergänzung ist dann angebracht, wenn diese Annahme nicht mehr zutrifft:

Kultur hoher Dichte und Fed-Batch-Kultur. Das ist der Hauptfall. Ein CHO- oder HEK-Fed-Batch-Lauf, der eine hohe lebende Zelldichte erreicht, verbraucht die Glucose des Startmediums lange vor dem Ende des Laufs. Glucose wird entweder als Teil eines vollständigen Feed-Supplements oder als separate konzentrierte Glucoselösung zugefüttert, gerade weil sie schneller verbraucht wird als die übrigen Bestandteile und daher unabhängig dosiert werden muss.

Lange Kulturen zwischen Mediumwechseln. Organoide, ausgedehnte Differenzierungsprotokolle und jede Kultur, die über ein langes Wochenende stehen bleibt, können in eine Glucoselimitierung geraten. Glucose zuzugeben ist ein schonenderer Eingriff als ein vollständiger Mediumwechsel, wenn die Kultur empfindlich ist oder der Zeitplan keinen Wechsel zulässt.

Stoffwechselaktive Zellen. Hybridome, aktivierte Lymphozyten und manche Primärzellen verbrauchen Glucose in Raten, die Standardformulierungen übersteigen.

Aufbau oder Anpassung eines Mediums. Wird ein Medium aus Pulver angesetzt oder ein Prozess auf eine eigene Formulierung umgestellt, dosiert man Glucose als separaten Bestandteil, damit sie variiert werden kann, ohne alles andere neu zu formulieren. Glucosefreie Feed-Supplemente existieren aus demselben Grund: Sie erlauben es der Prozessentwicklung, die Glucose unabhängig von der Aminosäure- und Vitaminzufuhr einzustellen.

Rettung einer unterversorgten Kultur. Zeigt eine Messung mitten im Lauf, dass die Glucose zur Neige geht, ist eine Bolusgabe die unmittelbare Abhilfe. Das ist eine Korrektur, keine Strategie, und die Strategie sollte anschließend überarbeitet werden.

Eine Ergänzung ist nicht schon deshalb angebracht, weil mehr Glucose besser klingt. Überschüssige Glucose in einer Kultur, die sie nicht nutzen kann, erzeugt mehr Lactat, nicht mehr Zellen.

Dass es zur Glucosezufütterung eine eigene Literatur gibt, liegt daran, dass die verfügbare Glucosemenge verändert, was die Zellen mit ihr tun - und nicht nur, wie lange sie durchhalten.

Das Lactatproblem. Zellen in glucosereichem Medium betreiben aerobe Glykolyse, wandeln Glucose in Lactat um, statt sie vollständig zu oxidieren, und das Lactat reichert sich an. Die berichteten Schwellenwerte hängen von Zelllinie und Prozess ab, doch eine Wachstumshemmung oberhalb von etwa 4 g/L Lactat wird in der CHO-Kultur breit beschrieben. Lactat zieht außerdem den pH-Wert nach unten, was der Bicarbonatpuffer abfangen muss und was im geregelten Bioreaktor wiederum eine Basenzugabe erfordert - dabei wird Natrium eingetragen und die Osmolalität steigt weiter.

Zwei Fütterungsphilosophien. Sie führen zu unterschiedlichen Prozessen:

Glucose-ausreichende Zufütterung hält die Glucose deutlich über null, typischerweise durch eine Bolusgabe zurück auf etwa 6 g/L, sobald der gemessene Wert unter rund 4 g/L fällt, oder durch eine geregelte Zufuhr einer konzentrierten Glucoselösung (400 g/L ist eine häufig berichtete Feed-Stammlösung), die einen Sollwert hält. Das ist einfach, robust und verzeiht seltenes Probenziehen. Es maximiert allerdings auch die Lactatbildung.

Glucose-limitierte Zufütterung hält die Restglucose bewusst niedrig, meist mit einem Zielbereich von 1-2 g/L und häufigen kleinen Bolusgaben alle 12-24 Stunden auf Basis der gemessenen Restglucose. Zellen ohne Glucoseüberschuss verlagern sich in Richtung oxidativen Stoffwechsel und beginnen in manchen Fällen, das zuvor gebildete Lactat wieder zu verbrauchen. Berichtet wurden Lactatminderungen von 60-80% gegenüber der Glucose-ausreichenden Zufütterung. Der Preis dafür ist der Bedarf an häufiger, genauer Glucosemessung: Der Abstand zwischen "limitiert" und "erschöpft" ist gering, und eine vollständig verbrauchte Glucose bringt eine Kultur zum Absturz.

Praktische Regeln, die in beiden Fällen gelten. Messen statt annehmen - die Glucoseverbrauchsrate ist über einen Lauf hinweg nicht konstant und steigt mit zunehmender Dichte steil an. Füttern Sie nach der Messung, nicht nach dem Kalender. Verwenden Sie die höchstkonzentrierte praktikable Stammlösung, um zugegebenes Volumen und schleichende Osmolalität gering zu halten. Und verfolgen Sie Lactat und Osmolalität parallel zur Glucose, denn die Glucose allein sagt Ihnen nicht, warum die Viabilität sinkt.

L-Glutamin ist die andere Hälfte des Bildes. L-Glutamin zerfällt in Lösung bei 37 Grad C spontan mit einer Halbwertszeit von rund sechs Tagen und setzt dabei Ammoniak frei, das toxisch ist. Eine Kultur, die über zwei Wochen mit Glucose gefüttert wird, ist zugleich eine Kultur, deren Glutamin die ganze Zeit zerfallen ist. Für Läufe mit mehr als drei bis fünf Tagen zwischen den Mediumwechseln vermeiden die stabilen Dipeptidformen - L-Alanyl-L-Glutamin oder gleichwertig - sowohl den Glutaminverlust als auch den Ammoniak.

Autoklavieren Sie Glucose niemals zusammen mit Aminosäuren. Reduzierende Zucker reagieren beim Erhitzen mit Aminogruppen - die Maillard-Reaktion - und bilden braune, chemisch komplexe Produkte, von denen einige zytotoxisch sind. Glucose karamellisiert bei Autoklaviertemperatur außerdem für sich allein. Ein Medium, das mit seiner Glucose autoklaviert wurde, ist ein anderes Medium als das auf dem Formulierungsblatt.

Richtig ist es, entweder die Glucoselösung durch eine 0.22-Mikrometer-Membran sterilzufiltrieren, was der Standard in der Zellkultur ist und das Problem vollständig vermeidet, oder die Glucoselösung getrennt von den aminosäurehaltigen Bestandteilen zu autoklavieren und beides anschließend aseptisch zu vereinigen. Die Filtration ist einfacher und ist das Verfahren, das kommerzielle sterile Glucoselösungen nutzen.

Eine Stammlösung mit 300 g/L ansetzen. Lösen Sie 300 g D-Glucose in Zellkulturqualität in etwa 700 mL Wasser in Zellkulturqualität, erwärmen Sie leicht, um das Lösen zu unterstützen, füllen Sie dann auf 1 L auf und filtrieren Sie bei 0.22 Mikrometer. Konzentrierte Glucose ist viskos und filtriert langsam; ein Vorfilter spart Membranen.

Lagerung. Sterile Glucoselösungen werden in der Regel bei 2-30 Grad C lichtgeschützt gelagert und haben eine Haltbarkeit von etwa 12 Monaten. Die konkreten Risiken sind: Auskristallisieren bei hoher Konzentration, wenn die Lösung kalt wird - reversibel durch vorsichtiges Erwärmen, aber vor der Verwendung vollständig wieder in Lösung zu bringen, da eine teilweise auskristallisierte Stammlösung weniger Glucose liefert als berechnet; und mikrobielles Wachstum, denn eine konzentrierte Zuckerlösung ist ein hervorragendes Nährmedium, sobald die Sterilität einmal verletzt ist. Eine trübe Glucose-Stammlösung gilt bis zum Beweis des Gegenteils als kontaminiert - verwerfen Sie sie.

Endotoxine und Wasserqualität. Die Glucose-Stammlösung geht in nennenswertem Volumen direkt ins Medium, das Wasser gelangt also unmittelbar zu den Zellen. Verwenden Sie Wasser in Zellkulturqualität mit ausgewiesener niedriger Endotoxinspezifikation, besonders bei Primärzellen und Immunzellen.

Überlegungen zur tierischen Herkunft. D-Glucose für die Zellkultur wird durch Stärkehydrolyse gewonnen und ist frei von tierischen Bestandteilen, was in einem regulierten Prozess eine Dokumentationspflicht weniger bedeutet.

Glucoseerschöpfung. Die Kultur wächst nicht mehr, die Viabilität fällt, und das Medium sieht womöglich gar nicht besonders sauer aus, weil die Zellen auch kein Lactat mehr bilden. Das ist mit routinemäßiger Glucosemessung vollständig vermeidbar, und es ist genau das Versagen, das glucoselimitierte Fütterungsstrategien riskieren, wenn zu selten gemessen wird.

Lactatanreicherung. Das Wachstum verlangsamt sich, obwohl noch reichlich Glucose vorhanden ist, das Medium wird schnell gelb, und die pH-Regelung im Bioreaktor erfordert immer mehr Basenzugabe. Die Antwort ist nicht mehr Glucose. Sie ist entweder eine glucoselimitierte Fütterungsstrategie oder ein Basalmedium mit niedrigerem Glucosegehalt.

Schleichend steigende Osmolalität. Später Viabilitätsverlust in einem Fed-Batch-Prozess, der auf dem Papier nährstofftechnisch in Ordnung aussieht. Jede Bolusgabe konzentrierten Feeds und jeder Milliliter Base gegen die Lactatansäuerung erhöhen die Osmolalität. Messen Sie sie, statt sie zu berechnen.

Ammoniak aus Glutamin. Wird oft der Glucosezufütterung angelastet, weil es zum gleichen Zeitpunkt im Lauf auftritt. Die Ursache ist der spontane Zerfall von Glutamin bei 37 Grad C, und die Abhilfe ist eine stabile Dipeptid-Glutaminquelle, keine Änderung des Glucoseregimes.

Bräunung des Mediums. Ein brauner oder bernsteinfarbener Ton, der sich in einem mit seiner Glucose autoklavierten Medium oder in einer zu stark hitzebehandelten Glucoselösung entwickelt, weist auf Maillard- oder Karamellisierungsprodukte hin. Filtrieren Sie stattdessen steril.

Artefakte durch hohen Glucosegehalt in der Biologie. Zellen, die bei 25 mM Glucose kultiviert werden, sehen die vier- bis fünffache physiologische Konzentration, was Stoffwechsel, Glykierung und Stressantworten verändert. Geht es in Ihrem Experiment um Stoffwechsel, Insulinsignalgebung, Diabetes oder irgendetwas, das der Nährstoffwahrnehmung nachgeschaltet ist, dann ist die Glucosekonzentration eine experimentelle Variable, die im Methodenteil genannt und begründet werden sollte - und nicht einfach von der Flasche übernommen, die gerade im Regal stand.