Zellzählung mit der Zählkammer

Die in der Zellkultur verwendete Zählkammer ist fast immer die verbesserte Neubauer-Zählkammer. Sie besteht aus einem dicken Glasobjektträger mit zwei polierten Zählflächen, die jeweils dasselbe eingeätzte Gitter tragen und durch Gräben voneinander getrennt sind. Erhöhte Stege zu beiden Seiten halten das Deckglas genau 0.1 mm über der geätzten Fläche, und diese feste Tiefe macht aus einer zweidimensionalen Zählung eine Volumenmessung.

Die geätzte Fläche misst 3 mm x 3 mm = 9 mm2 und ist in neun Quadrate von je 1 mm x 1 mm unterteilt:

• Die vier Eckquadrate sind jeweils in 16 Quadrate von 0.25 x 0.25 mm unterteilt. Diese Quadrate werden für die Zählung von Säugerzellen verwendet.
• Das Mittelquadrat ist in 25 mittlere Quadrate von 0.2 x 0.2 mm unterteilt, die ihrerseits nochmals in 16 kleine Quadrate von 0.05 x 0.05 mm geteilt sind — insgesamt 400 kleine Quadrate. Diese feinere Teilung ist für kleine, zahlreiche Partikel wie Erythrozyten und Thrombozyten gedacht.

Die Volumina ergeben sich unmittelbar aus Fläche x 0.1 mm Tiefe:

Der Wert 1 x 10^-4 mL ist der Ursprung des berühmten Faktors x 10^4. Eine Zählung in einem Eckquadrat ist eine Zählung in einem Zehntausendstel Milliliter, sodass die Multiplikation mit 10^4 sie in Zellen pro mL umrechnet. Mehr steckt hinter dem Faktor nicht, und er ändert sich, wenn Sie in einer Kammer anderer Tiefe zählen — manche Einwegkammern sind 0.02 mm oder 0.1 mm tief und haben einen anderen Multiplikator, der auf der Verpackung angegeben ist.

Auf der verbesserten Neubauer-Zählkammer sind die Grenzen der Quadrate von 1 mm2 als Dreifachlinien gezeichnet. Die mittlere Linie der Dreifachlinie ist die Zählgrenze. Das ist eine häufige Quelle stiller Fehler: Zählt man bis zur äußeren Linie, vergrößert man die Fläche und damit die Zählung um einige Prozent.

1. Kammer und Deckglas reinigen — mit 70% Ethanol und mit einem fusselfreien Tuch trocknen. Verwenden Sie das dicke, plangeschliffene Deckglas, das der Zählkammer beiliegt, und kein gewöhnliches Mikroskopie-Deckglas: Ein gewöhnliches Deckglas biegt sich durch, und die Kammertiefe beträgt dann nicht mehr 0.1 mm.
2. Das Deckglas aufsetzen. Befeuchten Sie die Stege durch Anhauchen nur ganz leicht und drücken Sie das Deckglas dann fest auf. Sitzt es richtig, erscheinen dort, wo Glas auf Glas trifft, Newtonsche Ringe — schwache Interferenzstreifen. Ihr Auftreten ist die einzige verlässliche Bestätigung, dass die Kammertiefe stimmt.
3. Eine echte Einzelzellsuspension herstellen. Zellklumpen machen die Zählung wertlos. Ausreichend trypsinieren, zum Vereinzeln vorsichtig pipettieren und bei aggregationsfreudigen Linien durch ein Zellsieb geben.
4. Unmittelbar vor der Probenahme mischen. Zellen setzen sich innerhalb einer Minute ab. Mehrmals auf- und abpipettieren oder das Röhrchen mehrmals invertieren und das Aliquot sofort aus mittlerer Tiefe entnehmen.
5. Mit Trypanblau verdünnen. Standard ist eine Mischung 1:1 — zum Beispiel 50 Mikroliter Zellsuspension plus 50 Mikroliter 0.4% Trypanblau, was einem Verdünnungsfaktor von 2 entspricht. Vorsichtig mischen und innerhalb von 3-5 Minuten zählen: Trypanblau ist zytotoxisch, und wenn die Mischung steht, nehmen auch lebende Zellen Farbstoff auf und die Viabilität fällt künstlich zu niedrig aus.
6. Die Kammer befüllen. Nehmen Sie etwa 10 Mikroliter auf, setzen Sie die Pipettenspitze an die Kerbe am Rand des Deckglases und lassen Sie die Probe durch Kapillarkraft einziehen. Befüllen Sie jede Kammer in einem durchgehenden Zug.
7. Die Füllung prüfen. Die geätzte Fläche sollte gleichmäßig bedeckt und blasenfrei sein. Ist Flüssigkeit in die Gräben gelaufen, wurde das Deckglas von seinen Stegen abgehoben und die Tiefe stimmt nicht — reinigen, trocknen und neu befüllen. Eine Unterfüllung hinterlässt trockene Stellen und verfälscht die Zählung in die andere Richtung.
8. Die Zellen etwa 1 Minute absitzen lassen, bevor Sie zählen, damit sie in einer einzigen Fokusebene liegen.

Bei Säugerzellen in Kultur zählen Sie die vier Eckquadrate von je 1 mm2. Manche Labore nehmen das Mittelquadrat hinzu und zählen fünf. Beide Konventionen sind zulässig; unzulässig ist der Wechsel zwischen ihnen, weil sich die Stichprobenstatistik unterscheidet.

Die Randlinienregel gibt es, weil eine Zelle, die auf einer Gitterlinie liegt, sonst zweimal gezählt würde — je einmal in den beiden angrenzenden Quadraten — oder ganz übersehen würde. Die Regel ist einfach:

Zählen Sie Zellen, die zwei aneinandergrenzende Seiten des Quadrats berühren — eine „L"-Form —, und schließen Sie Zellen aus, die die beiden anderen berühren.

Am gebräuchlichsten ist es, die obere und die linke Linie einzuschließen und die untere und die rechte auszuschließen; die spiegelbildliche Konvention mit oberer und rechter Linie ist ebenso richtig. Wählen Sie eine, schreiben Sie sie in Ihre Arbeitsanweisung und wenden Sie sie in jedem Quadrat und durch jede zählende Person identisch an. Eine Zelle wird danach beurteilt, wo der größere Teil ihres Körpers relativ zur mittleren Linie der Dreifachlinie liegt.

Zwei weitere Regeln zählen in der Praxis:

• Beide Kammern. Befüllen und zählen Sie beide Seiten des Objektträgers. Die beiden Zählungen sollten auf etwa 10% übereinstimmen. Tun sie das nicht, war die Suspension nicht richtig gemischt, die Kammer ungleichmäßig befüllt oder die Zellen verklumpen — dann neu befüllen, statt ein schlechtes Wertepaar zu mitteln.
• Dichtefenster. Streben Sie etwa 25 bis 100 Zellen je Eckquadrat von 1 mm2 an, was nach der Verdünnung einer Suspension von rund 2.5 x 10^5 bis 1 x 10^6 Zellen/mL entspricht. Unterhalb von etwa 25 je Quadrat dominiert das Stichprobenrauschen; oberhalb von etwa 100 überlagern sich Zellen und werden systematisch zu niedrig gezählt. Ist die Suspension zu dicht, verdünnen Sie weiter und protokollieren den zusätzlichen Faktor.

Die Genauigkeitsgrenze ist statistisch, nicht menschlich. Die Zellzählung folgt der Poisson-Statistik, sodass der Variationskoeffizient näherungsweise 1/sqrt(N) beträgt, wobei N die Gesamtzahl der gezählten Zellen ist. Bei 100 gezählten Zellen liegt der Variationskoeffizient bei etwa 10%, bei 200 bei etwa 7%, bei 400 bei etwa 5%. Keine noch so große Sorgfalt an einem einzelnen Quadrat mit 30 Zellen schlägt das — der einzige Weg zu einer engeren Zählung ist, mehr Zellen zu zählen.

Die Formel lautet:

Zellen/mL = (Gesamtzahl gezählter Zellen / Anzahl gezählter Quadrate) x Verdünnungsfaktor x 10^4

Der Verdünnungsfaktor ist das Gesamtvolumen geteilt durch das darin enthaltene Volumen an Zellsuspension. Eine Mischung 1:1 mit Trypanblau ergibt einen Verdünnungsfaktor von 2, nicht 1. Das ist der mit Abstand häufigste Rechenfehler bei der Zellzählung.

Rechenbeispiel. Eine T-75-Kulturflasche mit HeLa-Zellen wurde trypsiniert und in 10.0 mL Komplettmedium resuspendiert. 50 Mikroliter dieser Suspension werden mit 50 Mikrolitern 0.4% Trypanblau gemischt (VF = 2), davon werden 10 Mikroliter eingefüllt. Die vier Eckquadrate ergeben:

Konzentration lebender Zellen

84.0 x 2 x 10^4 = 1.68 x 10^6 lebende Zellen/mL

Gesamtkonzentration (lebend + tot)

(84.0 + 4.5) x 2 x 10^4 = 1.77 x 10^6 Zellen/mL

Insgesamt geerntete lebende Zellen

1.68 x 10^6 Zellen/mL x 10.0 mL = 1.68 x 10^7 lebende Zellen

Viabilität

336 / (336 + 18) x 100 = 94.9%

Beachten Sie, dass sich der Verdünnungsfaktor in der Viabilitätsberechnung herauskürzt und dort deshalb nicht auftaucht. Beachten Sie außerdem: 336 gezählte Zellen ergeben einen Variationskoeffizienten von etwa 5.5%, sodass die Konzentration korrekt als 1.7 x 10^6 Zellen/mL anzugeben ist — die Angabe 1.68 x 10^6 suggeriert eine Präzision, die die Methode nicht hat.

Jedes Eckquadrat enthielt zwischen 76 und 91 Zellen und lag damit im Fenster von 25-100, sodass keine weitere Verdünnung nötig war.

Trypanblau ist ein anionischer Diazofarbstoff, der eine intakte Plasmamembran nicht durchdringen kann. Zellen mit geschädigter Membran nehmen ihn auf und erscheinen deutlich blau und oft geschwollen; lebende Zellen schließen ihn aus und erscheinen hell, lichtbrechend und mit klaren Rändern. Die übliche Gebrauchslösung ist 0.4% (w/v) in Kochsalzlösung oder PBS.

Gemessen wird damit die Membranintegrität, und das ist enger gefasst als „Viabilität" im Alltagsgebrauch. Eine Zelle, die bereits in die Apoptose eingetreten ist, deren Membran aber noch intakt ist, gilt im Trypanblau-Test als lebend. Eine Zelle, die bei der Trypsinierung mechanisch geschädigt wurde, gilt als tot, obwohl die Population, aus der sie stammt, gesund ist. Der Trypanblau-Ausschlusstest ist das richtige Werkzeug für die routinemäßige Kontrolle einer Ernte und das falsche, um das Ergebnis eines Zytotoxizitätsversuchs zu messen — dort braucht es einen apoptosespezifischen oder metabolischen Test.

Praktische Punkte:

• Die Zeit zählt. Innerhalb von 3-5 Minuten nach dem Mischen zählen. Trypanblau ist selbst toxisch, und eine längere Einwirkung tötet Zellen und drückt den Viabilitätswert nach unten.
• Protein stört. Trypanblau bindet an Serumprotein, das den Hintergrund anfärbt und die Unterscheidung erschwert. Ist der Hintergrund stark blau, waschen Sie die Zellen vor dem Zählen in PBS.
• Erwarten Sie über 90% aus einer gesunden, sauber geernteten Kultur in der logarithmischen Wachstumsphase. Ein Ergebnis von 70-85% deutet auf zu langes Trypsinieren, eine überkonfluente Kulturflasche, zu grobes Pipettieren oder ein Kulturproblem hin, das vor dem Einsatz der Zellen zu klären ist.
• Zelltrümmer sind keine toten Zellen. Kleine, unregelmäßige blaue Bruchstücke sind Membrantrümmer und dürfen nicht mitgezählt werden. Zählen Sie nur Objekte von plausibler Zellgröße und -form.

Die Zählung nützt nur, wenn sie wieder in ein zu pipettierendes Volumen umgesetzt wird. Fortgesetzt am obigen Rechenbeispiel enthält die Suspension 1.68 x 10^6 lebende Zellen/mL.

Aufgabe: eine 6-Well-Platte mit 2 x 10^5 Zellen je Vertiefung in 2 mL Medium ausplattieren.

1. Zielkonzentration. 2 x 10^5 Zellen in 2 mL = 1 x 10^5 Zellen/mL.
2. Benötigtes Gesamtvolumen. Sechs Vertiefungen x 2 mL = 12 mL. Setzen Sie 13 mL an, um Pipettierverluste abzudecken.
3. Benötigte Gesamtzellzahl. 13 mL x 1 x 10^5 Zellen/mL = 1.3 x 10^6 Zellen.
4. Volumen der Ausgangssuspension. 1.3 x 10^6 / 1.68 x 10^6 Zellen/mL = 0.774 mL = 774 Mikroliter.
5. Ansetzen. Geben Sie 774 Mikroliter Zellsuspension zu 12.23 mL vorgewärmtem Komplettmedium, mischen Sie vorsichtig und verteilen Sie 2 mL je Vertiefung.
6. Gleichmäßig verteilen. Bewegen Sie die Platte vor und zurück und anschließend seitlich hin und her, bevor Sie sie in den Inkubator stellen. Kreisendes Schwenken treibt die Zellen in die Mitte jeder Vertiefung.

Dieselbe Rechnung steuert jede weitere Verwendung der Zählung: die Expansion in Kulturflaschen mit einer festgelegten Zellzahl je cm2, die Kryokonservierung mit einer festgelegten Zellzahl je mL und Röhrchen sowie das Ausplattieren von Testplatten. Behalten Sie die Konzentration in Zellen/mL als Arbeitsgröße und rechnen Sie erst am Ende einmal um.

Zellklumpen. Der schädlichste Fehler, weil er die Zählung verfälscht, ohne wie ein Fehler auszusehen. Verklumpte Zellen werden zu niedrig gezählt, Aussaatdichten fallen zu gering aus, und Ergebnisse sind nicht reproduzierbar. Ursachen sind eine unvollständige Trypsinierung, aus lysierten Zellen freigesetzte DNA und unzureichendes Mischen. Abhilfe: die Dissoziation etwas verlängern, dem Neutralisationsmedium DNase zusetzen, zum Vereinzeln vorsichtig pipettieren oder sieben. Versuchen Sie nicht, eine verklumpte Suspension zu zählen; bereiten Sie sie neu auf.

Flüssigkeit in den Gräben. Das Deckglas ist aufgeschwommen und die Kammer ist nicht mehr 0.1 mm tief, sodass jede daraus abgeleitete Zahl falsch ist. Reinigen, trocknen, das Deckglas neu aufsetzen, bis Newtonsche Ringe erscheinen, und neu befüllen.

Zu wenige Zellen je Quadrat. Unterhalb von etwa 25 je Eckquadrat überdeckt der Poisson-Fehler die Messung. Konzentrieren Sie die Suspension auf oder zählen Sie mehr Quadrate und passen Sie den Divisor entsprechend an.

Zu viele Zellen je Quadrat. Oberhalb von etwa 100 je Eckquadrat überlagern sich Zellen und werden zu niedrig gezählt. Verdünnen Sie und nehmen Sie den zusätzlichen Faktor in die Berechnung auf. Die Aufzeichnungen sollten die vollständige Verdünnungskette enthalten, nicht nur den letzten Trypanblau-Schritt.

Den Trypanblau-Verdünnungsfaktor vergessen. Halbiert jedes Ergebnis. Fällt eine Aussaatdichte genau halb oder doppelt so hoch aus wie erwartet, prüfen Sie zuerst den Verdünnungsfaktor.

Dieselbe Kammer zweimal zählen und das eine Wiederholung nennen. Dieselbe Kammer neu zu befüllen und neu zu zählen prüft Ihre Augen, nicht die Suspension. Echte Wiederholung heißt: beide Kammern, aus einer frisch gemischten Probe.

Absinken der Zellen im Röhrchen während einer langen Zählung. Das zweite eingefüllte Aliquot ist dünner als das erste. Mischen Sie unmittelbar vor jedem Befüllen.

Uneinheitliche Randlinienregel zwischen den Anwendern. Erzeugt einen systematischen Versatz zwischen Personen, die dieselbe Suspension zählen, typischerweise von einigen Prozent. Schreiben Sie die Konvention auf.

Verschmutzte oder zerkratzte Kammer. Schmutz in der Gitterätzung wird von müden Augen und von manchen automatischen Systemen als Zelle gezählt. Mit Ethanol und einem fusselfreien Tuch reinigen, niemals mit scheuerndem Material — die Teilung ist eingeätzt und kann dauerhaft beschädigt werden.

Die Zählkammer hält sich, weil sie günstig ist, nur 10 Mikroliter benötigt, keine Kalibrierung braucht und die zählende Person die Probe sehen lässt. Der letzte Punkt ist nicht nebensächlich: Verklumpung, Trümmer, Kontamination und unerwartete Morphologie sind bei einer manuellen Zählung alle sichtbar und in einer von einem Gerät gelieferten Zahl unsichtbar.

Ihre Schwächen sind Durchsatz und Abhängigkeit vom Anwender. Sie kostet mehrere Minuten je Probe, und verschiedene Personen, die unterschiedliche Randkonventionen und unterschiedliche Urteile darüber anwenden, was als Zelle gilt, weichen stärker voneinander ab als der statistische Fehler.

Automatische bildbasierte Zellzähler führen dieselbe Trypanblau-Chemie in einem Einwegobjektträger aus und wenden einen festen Algorithmus an, was den Anwendereinfluss ausschaltet und weniger als eine Minute je Probe braucht. Für die Routinezählung in größerem Umfang sind sie die richtige Wahl. Sie erben die blinden Flecken der Zählkammer — auch sie zählen Klumpen falsch — und müssen für jeden neuen Zelltyp gegen eine manuelle Zählung validiert werden, weil die Fenster für Größe und Rundheit auf typische Säugerzellen eingestellt sind.

Impedanzzähler nach dem Coulter-Prinzip zählen viele Tausend Partikel je Lauf und liefern eine ausgezeichnete Präzision der Gesamtpartikelzahl, unterscheiden aber nach Größe und nicht nach Membranintegrität — sie liefern also keinen Viabilitätswert und zählen Trümmer passender Größe als Zellen.

Die Durchflusszytometrie mit einem Viabilitätsfarbstoff liefert Daten je Einzelzelle über mehrere Parameter und kann apoptotische von nekrotischen Populationen unterscheiden. Sie braucht mehr Probenmaterial, mehr Vorbereitung und mehr Auswertung, und absolute Konzentrationen erfordern entweder Zählkügelchen oder ein volumetrisches Gerät. Setzen Sie sie ein, wenn die Frage dem Zustand der Zellen gilt und nicht bloß ihrer Zahl.