Subkultivierung von Zellen (Passagieren)

Ein Kulturgefäß bietet eine feste Wachstumsfläche und ein festes Medienvolumen. Während sich die Zellen teilen, verbrauchen sie Glucose und Glutamin, erschöpfen die Pufferkapazität des Mediums und reichern Laktat und Ammoniak an. Zugleich geht einem adhärenten Zellrasen die freie Oberfläche aus. Sobald die Fläche vollständig bedeckt ist, ist die Kultur konfluent, und von diesem Punkt an befindet sich die Population nicht mehr im ausgewogenen exponentiellen Wachstum.

Die Subkultivierung setzt beide Begrenzungen auf einmal zurück. Die Zellen werden abgelöst (adhärent) oder verdünnt (Suspension) und in geringerer Dichte mit frischem Medium auf neue Gefäße verteilt, wodurch die Population in die logarithmische Phase der Wachstumskurve zurückkehrt, in der die Verdopplungszeit konstant und die Physiologie reproduzierbar ist.

Drei voneinander unabhängige Dinge gehen schief, wenn eine Kultur über die Konfluenz hinaus stehen bleibt:

• Wachstumsstillstand. Kontaktinhibierte Linien wie NIH/3T3 stellen die Teilung ein, sobald sich der Zellrasen schließt, und lassen sich nur schwer sauber wieder in Gang bringen.
• Phänotypische Drift. Transformierte Linien, die nicht kontaktinhibiert sind, wachsen mehrschichtig auf, lösen sich in Lagen ab und können auf Varianten selektiert werden, die Gedränge tolerieren.
• Metabolischer Stress. Das Medium wird gelb, weil Laktat anfällt und der Bicarbonatpuffer überfordert ist. Allein die pH-Verschiebung senkt Viabilität und Anwachsrate bei der nächsten Passage, selbst wenn die Zellen in frischem Medium wieder gesund aussehen.

Der Subkultivierungsschritt ist außerdem der Punkt, an dem der größte Teil der Routinearbeit stattfindet: Zellzählung, Viabilitätskontrolle, Kryokonservierung, Probenahme für den Mykoplasmennachweis und das Ansetzen von Versuchsplatten hängen alle üblicherweise an einer Passage.

Die Konfluenz ist der Anteil der von Zellen bedeckten Wachstumsfläche, mit dem Auge am inversen Phasenkontrastmikroskop bei 4x oder 10x beurteilt. Sie ist eine visuelle Schätzung und keine Messung und braucht deshalb eine einheitliche Konvention im Team.

Der übliche Zielwert für kontinuierliche adhärente Linien liegt bei 70-80% Konfluenz. Bei dieser Dichte sind die Zellen noch in der Log-Phase, die Viabilität ist hoch, und sie erholen sich nach dem Teilen rasch. Deutlich früher zu passagieren verschwendet Zellen und kann die Lag-Phase verlängern; zu spät zu passagieren kostet Viabilität und Reproduzierbarkeit.

Praktische Anzeichen, dass eine Flasche so weit ist:

1. Bedeckung. Bei 70-80% hat sich der Zellrasen über den größten Teil der Fläche geschlossen, doch klare Lücken zwischen den Kolonien sind noch sichtbar. Bei 100% gibt es überhaupt keine Lücken mehr, und die Zellgrenzen bilden ein durchgehendes Mosaik.
2. Zellform. Gut ausgebreitete, gut anhaftende, lichtbrechende Zellen mit klaren Grenzen. Zellen, die sich abzurunden, zu granulieren oder zu vakuolisieren beginnen, sind bereits gestresst.
3. Farbe des Mediums. Mit Phenolrot liegt eine gesunde Kultur in der Log-Phase bei Orangerot. Ein Umschlag nach Gelborange zwischen den Fütterungen bedeutet meist, dass die Kultur dicht genug zum Teilen ist. Ein Umschlag nach Rosaviolett in einer dünn bewachsenen Flasche weist dagegen häufig auf schlechtes Wachstum oder eine undichte CO2-Versorgung des Inkubators hin, nicht auf Teilungsreife.
4. Schwebende Zelltrümmer. Eine zunehmende Zahl runder, phasenheller Schwimmer über dem Zellrasen zeigt an, dass die Kultur ihren besten Zeitpunkt überschritten hat.

Manche Linien haben eigene Regeln. NIH/3T3 muss subkultiviert werden, bevor die Konfluenz erreicht ist — die Zellen konfluent werden zu lassen, selektiert transformierte, fokusbildende Varianten und verändert die Linie dauerhaft. Humane diploide Fibroblastenstämme mit begrenzter Lebensdauer wie MRC-5 werden üblicherweise näher an 80-90% herangeführt. Primärkulturen und Stammzellen haben oft noch engere Fenster, die eher vom Differenzierungsprotokoll als von der Konfluenz allein bestimmt werden.

Für Suspensionskulturen gilt die Konfluenz nicht. Der entsprechende Auslöser ist die Zellkonzentration: Zählen Sie die Kultur mindestens zweimal pro Woche und verdünnen Sie zurück, bevor die Dichte an das obere Ende des für die Linie tolerierten Bereichs stößt.

Die folgenden Volumina gelten für eine T-75-Flasche (75 cm2). Skalieren Sie näherungsweise mit der Wachstumsfläche: Eine T-25 braucht etwa ein Drittel, eine T-175 etwa das 2.3-Fache. Erwärmen Sie das Medium vor Gebrauch auf 37 °C; halten Sie Trypsin-EDTA bei Raumtemperatur oder erwärmen Sie es nur kurz und lassen Sie es nicht über längere Zeit bei 37 °C stehen, weil Trypsin sich selbst verdaut.

1. Kultur prüfen. Bestätigen Sie 70-80% Konfluenz und dass das Medium klar ist, ohne Trübung oder unerwartete pH-Verschiebung. Notieren Sie die Passagenzahl auf der Flasche.
2. Medium entfernen. Saugen Sie das gesamte verbrauchte Medium ab und verwerfen Sie es. Serumreste sind der Hauptgrund für eine misslungene Trypsinierung, denn Serum enthält Alpha-1-Antitrypsin und weitere Proteaseinhibitoren.
3. Waschen. Geben Sie 5-10 mL Ca2+/Mg2+-freies DPBS oder PBS zu, schwenken Sie sanft über den Zellrasen und saugen Sie ab. Calcium und Magnesium werden von den Cadherin- und Integrinverbindungen benötigt, die Sie lösen wollen, deshalb muss der Waschpuffer frei von beiden sein. Waschen Sie zweimal, wenn die Linie in serumreichem Medium wächst.
4. Mit Trypsin spülen (optional, aber nützlich). Geben Sie 1-2 mL Trypsin-EDTA zu, schwenken Sie zum Bedecken und saugen Sie sofort wieder ab. Das entfernt den letzten Inhibitorfilm.
5. Trypsin-EDTA zugeben. Geben Sie 2-3 mL 0.25% Trypsin mit 0.53 mM EDTA zu (oder 0.05% Trypsin-EDTA bei empfindlichen oder locker anhaftenden Linien) und schwenken Sie so, dass die gesamte Fläche bedeckt ist.
6. Inkubieren. Stellen Sie die Flasche zurück auf 37 °C und kontrollieren Sie nach 2 Minuten unter dem Mikroskop, danach jede Minute. Die meisten Linien lösen sich in 2-10 Minuten ab; einige fest anhaftende Linien brauchen bis zu 15. Stellen Sie nicht einfach einen Wecker und gehen Sie weg -- eine zu lange Trypsinierung ist die mit Abstand häufigste Ursache für schlechte Erholung.
7. Zellschicht lösen. Wenn die Zellen abgerundet sind und die Schicht zu gleiten beginnt, schlagen Sie die Flasche seitlich scharf gegen den Handballen, um sie zu lösen. Unter dem Mikroskop sollten Sie eine Suspension einzelner runder Zellen sehen, keine Schichten oder Stränge.
8. Neutralisieren. Geben Sie 6-8 mL vollständiges serumhaltiges Wachstumsmedium zu und pipettieren Sie sanft über die Wachstumsfläche, um restliche Zellen abzuspülen und Klumpen zu zerteilen. Verwenden Sie in serumfreien Systemen stattdessen einen definierten Trypsininhibitor wie Sojabohnen-Trypsininhibitor -- serumfreies Medium allein stoppt die Reaktion nicht.
9. Bei Bedarf zählen. Nehmen Sie ein Aliquot für eine Zählung in der Zählkammer mit Trypanblau. Bei jeder Passage zu zählen ist gute Praxis und immer dann erforderlich, wenn eine definierte Aussaatdichte vorgegeben ist.
10. Zentrifugation (optional). Bei Linien, die auf Trypsinreste empfindlich reagieren, oder wenn auf eine andere Medienformulierung gewechselt wird, zentrifugieren Sie 5 Minuten bei 100-200 x g, verwerfen den Überstand und resuspendieren in frischem Medium. Lassen Sie diesen Schritt bei robusten Linien weg: Pelletieren und Resuspendieren kosten Viabilität.
11. Neu aussäen. Verteilen Sie die Suspension im gewählten Teilungsverhältnis oder mit der gewählten Aussaatdichte auf neue Flaschen, füllen Sie auf das Arbeitsvolumen auf (15-20 mL für eine T-75) und beschriften Sie mit Linie, neuer Passagenzahl und Datum.
12. Zurück in den Inkubator. Bewegen Sie die Flasche vor und zurück sowie von Seite zu Seite -- niemals im Kreis schwenken, denn das sammelt die Zellen in der Mitte -- und stellen Sie sie flach bei 37 °C und 5% CO2 ab.

Je nach Linie sollten die Zellen innerhalb von 4-24 Stunden angewachsen sein und sich auszubreiten beginnen.

Suspensionslinien benötigen keine Dissoziation, das Passagieren ist also eine Verdünnung.

1. Kultur zählen und die Viabilität prüfen. Darauf beruht die gesamte Entscheidung, dieser Schritt darf also nicht entfallen.
2. Sanft resuspendieren, durch Schwenken oder Umdrehen des Gefäßes, damit das entnommene Aliquot repräsentativ ist.
3. In frisches, vorgewärmtes Medium zurückverdünnen, auf die für die Linie empfohlene Aussaatkonzentration -- bei lymphoblastoiden Linien wie Jurkat häufig 1 x 10^5 bis 3 x 10^5 lebende Zellen/mL.
4. Alternativ: teilweiser Medienwechsel. Lassen Sie die Zellen bei dichten Kulturen absetzen oder zentrifugieren Sie 5 Minuten bei 100-200 x g, entfernen Sie einen festgelegten Anteil des konditionierten Mediums und ersetzen Sie ihn durch frisches. Manche Linien wachsen besser, wenn ein Anteil konditionierten Mediums erhalten bleibt.
5. Zurück in den Inkubator. Geschüttelte Kulturen und Spinnerkulturen kommen mit der validierten Rührrate zurück auf die Plattform; statische Suspensionskulturen kommen flach zurück.

Die beiden Fehlerbilder sind gegensätzlich und gleich schädlich. Die Dichte zu weit ansteigen zu lassen, erschöpft das Medium und lässt die Viabilität stark abfallen -- Jurkat-Kulturen zum Beispiel sollten 3 x 10^6 Zellen/mL nicht überschreiten. Zu weit zu verdünnen drängt die Kultur in eine verlängerte Lag-Phase, aus der sich manche Linien nie vollständig erholen; teilen Sie eine Linie zurückhaltender, wenn sie gerade aufgetaut wurde oder schlecht wächst.

Ein Teilungsverhältnis gibt an, wie stark die Zellen verdünnt werden: Ein Teilungsverhältnis von 1:4 verteilt den Inhalt einer konfluenten Flasche auf vier neue Flaschen derselben Größe. Es geht schnell, kommt ohne Zählung aus und ist für gut charakterisierte, robuste Linien mit festem Zeitplan völlig ausreichend.

Eine Aussaatdichte in lebenden Zellen/cm2 oder Zellen/mL ist die genauere Vorgabe. Sie erfordert eine Zählung, ist aber über Personen, Gefäßtypen und Konfluenzschätzungen hinweg reproduzierbar, und sie ist das, was Versuchsprotokolle vorgeben.

Verbunden sind beide über die konfluente Dichte der Linie. Erreicht eine Linie die Konfluenz bei etwa 1 x 10^5 Zellen/cm2 und teilen Sie 1:8, dann säen Sie rund 1.25 x 10^4 Zellen/cm2 aus.

Die Wahl des Verhältnisses hängt an der Verdopplungszeit und dem gewünschten Intervall:

• Eine Linie mit einer Verdopplungszeit von 24 Stunden gewinnt in 72 Stunden etwa 3 Verdopplungen (8x), ein Teilungsverhältnis von 1:8 am Freitag bringt sie also bis etwa Montag wieder zur Konfluenz.
• Dieselbe Linie ist bei 1:4 in ungefähr 48 Stunden so weit.
• Langsam wachsende Linien und Stämme mit begrenzter Lebensdauer vertragen nur flache Teilungen -- typischerweise 1:2 bis 1:4 --, weil eine tiefe Teilung sie unter die Dichte bringt, bei der sie gut wachsen, und weil jede Passage eines Stammes mit begrenzter Lebensdauer einen Teil dieser festen Lebensspanne aufbraucht.

Zwei praktische Warnungen. Erstens sind Teilungsverhältnisse nicht über Gefäßformate hinweg übertragbar: Eine T-75 "1:4" auf vier T-25 zu teilen, ist flächenbezogen in Wirklichkeit ein Verhältnis von 1:1.3. Rechnen Sie immer in Wachstumsfläche oder in Zellen/cm2. Zweitens sollten Sie die Teilungstiefe für die ersten zwei bis drei Passagen verringern, wenn eine Linie aus flüssigem Stickstoff zurückgeholt wird; aufgetaute Zellen haben eine geringere Anwachsrate.

Die Passagenzahl zählt Subkultivierungsereignisse. Sie erhöht sich bei jedem Teilen um eins, unabhängig davon, wie tief geteilt wurde. Sie ist eine Buchhaltungskonvention und kein Maß für das biologische Alter, und ihre Bedeutung hängt vollständig von den unterwegs verwendeten Teilungsverhältnissen ab.

Das Populationsverdopplungsniveau (PDL) ist die biologisch aussagekräftige Größe: die kumulierte Zahl der Verdopplungen der Population. Für jede Passage gilt:

PD = 3.32 x [ log10(geerntete Zellen) - log10(ausgesäte Zellen) ]

und das PDL ist die laufende Summe. Ein Teilungsverhältnis von 1:2 fügt eine Verdopplung hinzu, eines von 1:8 drei. Zwei Labore, die beide bei "Passage 20" stehen, können sich um mehr als 40 Verdopplungen unterscheiden.

Das ist wichtig, weil sich das Verhalten der Zellen mit der Zeit in Kultur ändert:

• Zellstämme mit begrenzter Lebensdauer haben eine feste replikative Lebensspanne (das Hayflick-Limit) und treten danach in eine irreversible Seneszenz ein. Die ATCC gibt an, dass MRC-5 vor dem Einsetzen der Seneszenz zu 42 bis 46 Populationsverdopplungen fähig ist. Nähert sich der Stamm dieser Grenze, verlängert sich die Verdopplungszeit, die Zellen werden größer und flacher, und die Sättigungsdichte sinkt.
• Kontinuierliche Zelllinien sind unsterblich, aber nicht stabil. Karyotyp, Rezeptorexpression, Wirkstoffempfindlichkeit, Transfektionseffizienz und Wachstumsrate driften über längeres Passagieren hinweg alle ab. Publizierte Unterschiede zwischen Laboren lassen sich häufig auf Bestände mit hoher Passagenzahl zurückführen.

Die übliche Kontrolle ist eine zweistufige Zellbank: eine Masterbank, bei niedriger Passagenzahl aus dem Originalröhrchen eingefroren, und daraus vermehrte Arbeitsbanken. Die Routinekultur läuft aus einem Arbeitsröhrchen über eine festgelegte Zahl von Passagen -- häufig 15-20, bei empfindlichen Assays 10 --, wird dann verworfen, und ein frisches Röhrchen wird aufgetaut. Dokumentieren Sie die Passagenzahl auf jeder Flasche und im Kulturprotokoll und übernehmen Sie sie in jede Versuchsdokumentation.

Die Logik der Subkultivierung ist für beide gleich, doch fast jedes praktische Detail unterscheidet sich.

Adhärente Kulturen sind durch die Oberfläche begrenzt, brauchen einen Dissoziationsschritt, werden nur bei der Passage gezählt und werden durch zusätzliche Gefäße oder den Wechsel auf Rollerflaschen und Mehrlagenflaschen hochskaliert. Der Dissoziationsschritt ist die Stelle, an der Schäden entstehen: Trypsin spaltet Oberflächenproteine einschließlich Rezeptoren, und eine verlängerte Einwirkung senkt die Viabilität und verzögert das erneute Anwachsen. Das mildeste Reagenz zu wählen, das noch funktioniert -- 0.05% Trypsin-EDTA, EDTA/Versen allein oder ein rekombinantes bzw. enzymfreies Dissoziationsreagenz --, ist die zusätzliche Minute Inkubation meist wert.

Suspensionskulturen sind durch Medienvolumen und Gasaustausch begrenzt, brauchen keine Dissoziation, müssen routinemäßig und nicht nur bei der Passage gezählt werden und lassen sich über das Volumen unkompliziert in Schüttelkolben, Spinner und Bioreaktoren hochskalieren. Ihre Fehlerbilder sind Aggregation, Scherschäden bei hoher Rührgeschwindigkeit und der Dichteeinbruch nach einer überwachsenen Kultur.

Manche Linien existieren in beiden Formen. HEK293 und CHO sind die geläufigen Beispiele: Die adhärente Ausgangslinie und eine an Suspension adaptierte Ableitung sind nicht austauschbar, und die Adaptation zwischen beiden dauert Wochen schrittweiser Überführung, nicht eine einzige Passage.

Die Zellen lösen sich nicht ab. Serumreste sind die übliche Ursache -- waschen Sie erneut mit Ca2+/Mg2+-freiem Puffer. Weitere Ursachen sind Trypsin, das durch wiederholtes Erwärmen oder Einfrieren und Auftauen an Aktivität verloren hat, ein überkonfluenter Zellrasen mit ausgedehnten Zell-Zell-Verbindungen oder eine Linie, die schlicht ein stärkeres Reagenz braucht (0.25% statt 0.05% oder eine kurze Vorinkubation mit EDTA).

Die Zellen lösen sich ab, wachsen aber nicht wieder an. Zu lange trypsiniert. Anzeichen sind eine lange Lag-Phase, eine geringe Anwachsrate und ein steigender Anteil schwimmender Zellen. Verkürzen Sie die Inkubation, gehen Sie auf 0.05% Trypsin herunter, neutralisieren Sie sofort und vollständig und ziehen Sie ein nicht enzymatisches Reagenz in Betracht.

Klumpenbildung nach der Dissoziation. Meist freigesetzte DNA aus lysierten Zellen. Geben Sie eine niedrige Konzentration DNase in das Neutralisationsmedium oder verkürzen Sie die Trypsinierungszeit. Klumpen verderben sowohl die Zellzählung als auch die gleichmäßige Aussaat.

Ungleichmäßiger Zellrasen, Zellen in der Mitte oder am Rand angehäuft. Die Flasche wurde im Kreis geschwenkt statt gekippt, oder sie wurde bewegt, bevor die Zellen abgesetzt waren. Bewegen Sie sie vor und zurück, dann von Seite zu Seite, und stellen Sie sie ungestört ab.

Das Wachstum wird über aufeinanderfolgende Passagen langsamer. Prüfen Sie zuerst das PDL -- ein Stamm mit begrenzter Lebensdauer nähert sich möglicherweise einfach der Seneszenz. Andernfalls kommen Mykoplasmen in Frage (mit dem Auge unsichtbar und die mit Abstand häufigste Ursache unerklärlich langsamen Wachstums), eine schlechte Serumcharge, ein Abdriften von CO2 oder Feuchte im Inkubator oder aufsummierte Schäden durch zu lange Trypsinierung.

Die Kultur erreicht die Konfluenz viel zu schnell oder zu langsam. Das Teilungsverhältnis passt nicht mehr zur Verdopplungszeit, die sich ihrerseits mit der Drift einer Linie ändert. Zählen Sie neu, berechnen Sie die Aussaatdichte neu und passen Sie an, statt am überlieferten Verhältnis festzuhalten.

Eine Kontamination tritt bei einer bestimmten Passage auf. Gehen Sie zu den gemeinsam genutzten Reagenzflaschen zurück, die an diesem Termin geöffnet wurden. Aliquotieren Sie Medien und Supplemente in Einmalvolumina, damit sich ein Kontaminationsereignis nicht über eine ganze Zellbank ausbreiten kann.