Selektionsantibiotika für Säugerzelllinien

Selektionsantibiotika erfüllen die genau entgegengesetzte Aufgabe wie das Penicillin–Streptomycin in einem Erhaltungsmedium. Kulturantibiotika werden in Konzentrationen eingesetzt, die Säugerzellen vertragen, um Bakterien zu unterdrücken. Selektionsantibiotika werden in Konzentrationen eingesetzt, die Säugerzellen abtöten, um jede Zelle aus der Schale zu entfernen, die kein bestimmtes Resistenzgen erworben hat.

Der Arbeitsablauf ist immer derselbe. Ein Resistenzgen wird auf demselben Konstrukt wie Ihr Zielgen eingebracht — durch Plasmidtransfektion, lentivirale oder retrovirale Transduktion oder einen gezielten Knock-in. Wenige Tage später kommt das Selektionsmittel ins Medium. Zellen, die das Resistenzgen exprimieren, überleben; alles andere stirbt ab. Zurück bleibt eine polyklonale resistente Population, aus der anschließend durch Einzelzellklonierung eine stabile Zelllinie hervorgehen kann.

Zwei Dinge entscheiden darüber, ob das gelingt: die Wahl eines Mittels, dessen Resistenzgen auf Ihrem Konstrukt liegt, und die richtige Konzentration. Am zweiten Punkt scheitern die meisten Selektionen, und genau deshalb ist die unten beschriebene Abtötungskurve nicht optional.

Eine Anmerkung zur Nomenklatur, die beim Bestellen immer wieder Verwirrung stiftet: G418, Geneticin und G-418-Sulfat sind dasselbe Aminoglykosid. Zeocin und Phleomycin D1 sind dasselbe Glykopeptid aus der Bleomycin-Familie. Blasticidin und Blasticidin S sind dasselbe Peptidyl-Nukleosid.

G418 / Geneticin ist ein Aminoglykosid aus Micromonospora rhodorangea. Es blockiert die Polypeptidsynthese, indem es die Funktion des 80S-Ribosoms stört, und ist daher für eukaryotische wie für prokaryotische Zellen toxisch. Die Resistenz vermittelt neo (auch nptII genannt), eine Aminoglykosid-3'-Phosphotransferase aus dem Transposon Tn5, die den Wirkstoff phosphoryliert und inaktiviert. G418 ist das langsamste der fünf Mittel: Rechnen Sie mit 7–14 Tagen bis zur vollständigen Selektion. Eine praktische Falle — G418 als Pulver wird mit einer angegebenen Wirkstärke in µg aktiver Substanz pro mg Pulver verkauft, typischerweise deutlich unter 1000 µg/mg, und diese schwankt von Charge zu Charge. Konzentrationen müssen auf Basis der aktiven Substanz berechnet werden, nicht auf Basis der Pulvereinwaage. Fertiglösungen (zum Beispiel 50 mg/mL) beseitigen dieses Problem vollständig.

Hygromycin B ist ein Aminoglykosid aus Streptomyces hygroscopicus, das die Proteinsynthese hemmt, indem es die Translokation am 80S-Ribosom stört und Fehltranslationen begünstigt. Die Resistenz vermittelt hph (auch hyg geschrieben), die Hygromycin-B-Phosphotransferase, ursprünglich aus E. coli. Der Arbeitsbereich ist breit — 50–1000 µg/mL — und die Selektion dauert typischerweise 7–14 Tage.

Blasticidin S ist ein Peptidyl-Nukleosid aus Streptomyces griseochromogenes, das die Bildung der Peptidbindung sowohl am 70S- als auch am 80S-Ribosom hemmt. Zwei Resistenzgene sind gebräuchlich: bsd, eine Blasticidin-S-Desaminase aus Aspergillus terreus, und bsr, eine Desaminase aus Bacillus cereus. Beide überführen Blasticidin in eine nicht toxische desaminierte Form. Blasticidin wirkt mit Abstand in den niedrigsten Konzentrationen der fünf Mittel — 1–20 µg/mL, üblich sind 2–10 — und tötet schnell: Morphologische Veränderungen sind oft schon innerhalb von 48 Stunden sichtbar, und die Selektion ist nach etwa 3–10 Tagen abgeschlossen.

Zeocin (Phleomycin D1) ist ein kupferkomplexiertes Glykopeptid der Bleomycin-Familie aus Streptomyces verticillus. Anders als die anderen vier greift es nicht das Ribosom an: Es interkaliert in die DNA und spaltet sie und tötet damit sowohl sich teilende als auch ruhende Zellen ab. Die Resistenz vermittelt Sh ble aus Streptoalloteichus hindustanus, dessen Produkt den Wirkstoff stöchiometrisch und nicht enzymatisch bindet — ein Proteinmolekül fängt ein Wirkstoffmolekül ab. Dieser Mechanismus bedeutet, dass die Resistenz sättigbar ist: Eine zu hoch gewählte Konzentration tötet auch die resistenten Zellen. Die Aktivität von Zeocin ist Berichten zufolge in salzreichen Medien und oberhalb von etwa pH 7.5 vermindert. Halten Sie das Selektionsmedium daher nahe pH 7.0–7.5 und bedenken Sie, dass eine gescheiterte Zeocin-Selektion oft ein Problem der Medienchemie und nicht der Konzentration ist. Behandeln Sie es als DNA-schädigende Substanz und schützen Sie Lösungen vor Licht.

Puromycin ist ein Aminonukleosid aus Streptomyces alboniger. Es ist ein Strukturanalogon des 3'-Endes der Aminoacyl-tRNA, gelangt daher in die A-Stelle des Ribosoms, wird in die wachsende Kette eingebaut und führt zum vorzeitigen Kettenabbruch. Die Resistenz vermittelt pac, die Puromycin-N-Acetyltransferase, die den Wirkstoff acetyliert und inaktiviert. Puromycin ist das schnellste Mittel — 0.5–10 µg/mL, üblich sind 1–5, untransfizierte Zellen sterben in 2–4 Tagen — und deshalb die Standardwahl für lentivirale Arbeitsabläufe, bei denen es auf Tempo ankommt.

In der Praxis entscheidet das Resistenzgen auf Ihrem Konstrukt die Frage für Sie. Wenn Sie tatsächlich die Wahl haben:

• Geschwindigkeit: Puromycin (2–4 Tage) < Blasticidin (3–10 Tage) < Zeocin und Hygromycin B (7–14 Tage) ≈ G418 (7–14 Tage).
• Kosten pro Liter Selektionsmedium: Blasticidin und Puromycin werden in Konzentrationen im Bereich von Mikrogramm pro mL eingesetzt; trotz höherer Preise pro mg sind sie im Gebrauch daher oft günstiger als G418 oder Hygromycin B bei mehreren Hundert Mikrogramm pro mL.
• Doppel- und Dreifachselektion: Die fünf Mittel haben unterschiedliche Wirkmechanismen und unterschiedliche Resistenzgene und lassen sich deshalb kombinieren. Ein gängiges Muster ist Puromycin für das erste und Blasticidin für das zweite Konstrukt, da zwischen beiden keine Kreuzresistenz besteht.
• Expressionsniveau: Veröffentlichte Vergleiche von Selektionssystemen in denselben Zellen berichten, dass die Wahl des Selektionsmarkers die mittlere Transgenexpression um ein Mehrfaches verschieben kann und beeinflusst, wie einheitlich die Expression über die Population hinweg ist. Wenn eine gleichmäßige Expression für Ihren Assay wichtig ist, lohnt es sich, den Marker bewusst zu wählen und nicht nach Bequemlichkeit.
• Ruhende Zellen: Zeocin ist das einzige der fünf Mittel, das nicht teilende Zellen ebenso abtötet wie sich teilende — entscheidend für langsam wachsende Primärkulturen.

Die veröffentlichten Bereiche umfassen eine Größenordnung oder mehr, weil die Empfindlichkeit zwischen Zelltypen tatsächlich so stark schwankt. HEK293-Zellen brauchen unter Umständen 400 µg/mL G418, während eine primäre Fibroblastenlinie 1000 benötigt. Aus einem Katalog lässt sich das nicht ableiten, und die beiden Fehlerarten sind gleich teuer: zu niedrig, und untransfizierte Zellen überleben, sodass Ihre „stabile“ Linie einen Hintergrund nicht exprimierender Zellen enthält; zu hoch, und Sie töten auch die resistenten Zellen ab — besonders bei Zeocin, wo die Resistenz sättigbar ist.

Führen Sie die Abtötungskurve an der untransfizierten Ausgangslinie durch, im selben Medium, bei derselben Aussaatdichte und im selben Plattenformat, das Sie für die eigentliche Selektion verwenden werden. Vor allem die Dichte ist entscheidend — ein konfluenter Monolayer widersteht der Selektion weit besser als eine dünn besiedelte Kultur, sodass eine bei falscher Dichte erstellte Kurve ein Ergebnis liefert, das sich nicht übertragen lässt.

Protokoll

1. Säen Sie die untransfizierten Ausgangszellen mit 0.5 mL pro Well in eine 24-Well-Platte aus. Für adhärente Linien verwenden Sie 0.8–3.0 × 10⁵ Zellen/mL, für Suspensionslinien 2.5–5.0 × 10⁵ Zellen/mL. Streben Sie zum Zeitpunkt der Zugabe des Mittels 50–80 % Konfluenz an — dieselbe Dichte, bei der Sie die eigentliche Selektion durchführen werden. Verwenden Sie für jede Konzentration Doppelansätze.
2. Lassen Sie die Zellen anheften und ihr Wachstum wieder aufnehmen, bei adhärenten Linien in der Regel über Nacht.
3. Stellen Sie eine Verdünnungsreihe des Mittels in vollständigem Wachstumsmedium her, einschließlich eines Kontrollwells ohne Antibiotikum. Ausgearbeitete Reihen für jedes Mittel finden Sie weiter unten.
4. Tauschen Sie das Medium in jedem Well gegen das entsprechende antibiotikahaltige Medium aus. Behandeln Sie die Nullkontrolle genau gleich, mit Mediumwechsel, aber ohne Wirkstoff — sie kontrolliert die Handhabung und nicht nur den Wirkstoff.
5. Erneuern Sie das antibiotikahaltige Medium alle 2–3 Tage über den gesamten Selektionszeitraum. Dieser Schritt wird am häufigsten ausgelassen, und ihn auszulassen macht die Kurve ungültig: Die Mittel zerfallen im Medium bei 37 °C, und Zelltrümmer sammeln sich an.
6. Begutachten Sie jedes Well täglich unter dem Mikroskop und notieren Sie den ungefähren Anteil toter oder abgelöster Zellen. Eine einfache Tagestabelle Well gegen prozentuale Abtötung genügt.
7. Führen Sie die Kurve über das normale Selektionsfenster des Mittels — bis zu 4 Tage bei Puromycin, bis zu 10 Tage bei Blasticidin und 10–14 Tage bei G418, Hygromycin B und Zeocin.
8. Lesen Sie das Ergebnis ab. Die Arbeitskonzentration ist die niedrigste Konzentration, die innerhalb des normalen Zeitfensters des Mittels 100 % der Zellen abtötet. Tötet bereits an Tag 2 jede Konzentration alles ab, war die Reihe zu hoch angesetzt — wiederholen Sie sie mit niedrigeren Werten. Bleiben bei der höchsten Konzentration Überlebende zurück, erweitern Sie den Bereich nach oben.
9. Bestätigen Sie den Wert an der resistenten Population. Sobald Sie transfizierte Zellen haben, prüfen Sie, ob diese die gewählte Konzentration vertragen. Ist das nicht der Fall, wird der Marker zu schwach exprimiert, und das Problem liegt am Konstrukt oder am Promotor, nicht an der Konzentration.

Ausgearbeitete Konzentrationsreihen (alle in vollständigem Wachstumsmedium, Doppelansätze, Nullkontrolle eingeschlossen):

• Puromycin: 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10 µg/mL. Aus einer Stammlösung von 10 mg/mL entspricht 1 µg/mL einer Verdünnung von 1:10000 — stellen Sie eine Zwischenverdünnung von 100 µg/mL her, statt Volumina im Submikroliterbereich zu pipettieren.
• Blasticidin S: 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20 µg/mL. Aus einer Stammlösung von 10 mg/mL entspricht 10 µg/mL einer Verdünnung von 1:1000.
• G418 / Geneticin: 0, 100, 200, 400, 600, 800, 1000, 1500, 2000 µg/mL. Aus einer Lösung von 50 mg/mL entspricht 800 µg/mL einer Verdünnung von 1:62.5 — das sind 8 mL auf 500 mL Medium.
• Hygromycin B: 0, 50, 100, 200, 300, 400, 600, 800, 1000 µg/mL. Aus einer Lösung von 50 mg/mL entspricht 300 µg/mL einer Verdünnung von 1:167.
• Zeocin: 0, 50, 100, 200, 300, 400, 600, 800, 1000 µg/mL. Aus einer Lösung von 100 mg/mL entspricht 200 µg/mL einer Verdünnung von 1:500. Prüfen und dokumentieren Sie den pH-Wert des Mediums, da die Zeocin-Aktivität oberhalb von etwa pH 7.5 abfällt.

Wiederholen Sie die Abtötungskurve immer dann, wenn Sie Zelllinie, Basalmedium, Serumkonzentration oder Plattenformat wechseln. Besonders die Serumkonzentration verschiebt das Ergebnis, weil Serumprotein einen Teil des Wirkstoffs bindet.

Das sind zwei verschiedene Werte, und sie zu verwechseln führt zu vermeidbaren Verlusten.

Die Selektionskonzentration ist der Wert aus der Abtötungskurve — die Dosis, die 100 % der untransfizierten Zellen beseitigt. Verwenden Sie sie vom Beginn der Selektion an, bis die resistente Population etabliert ist und expandiert, typischerweise über das gesamte Selektionsfenster hinweg und einige Passagen darüber hinaus.

Die Erhaltungskonzentration hält das Resistenzgen unter genügend Druck, um Silencing oder Verlust zu verhindern, ohne eine etablierte Linie dauerhaft zu belasten. Sie beträgt konventionell etwa die Hälfte der Selektionskonzentration, und viele Labore gehen noch weiter: Sie kultivieren die etablierte stabile Linie ganz ohne Wirkstoff und geben die Erhaltungskonzentration alle vier bis sechs Wochen für eine Passage wieder zu, oder vor der Expansion für ein wichtiges Experiment.

Setzen Sie das Mittel vor funktionellen Assays nach Möglichkeit vollständig ab. Puromycin hemmt in Selektionskonzentrationen die Translation in jeder Zelle bis zu einem gewissen Grad; Zeocin ist eine DNA-schädigende Substanz; die Aminoglykoside beeinträchtigen die mitochondriale Translation. Keine dieser Größen möchte man als Variable in einer Phänotypmessung haben.

• Die Konzentration wurde für diese Linie nie bestimmt. Die häufigste Ursache. Ein Wert aus einer Veröffentlichung zu einem anderen Zelltyp in einem anderen Medium ist geraten.
• Die Zellen waren zu dicht. Konfluente Kulturen widerstehen der Selektion. Wiederholen Sie den Versuch bei der Dichte, die Sie tatsächlich verwenden werden.
• Das Medium wurde nicht oft genug gewechselt. Diese Mittel zerfallen bei 37 °C. Alle 2–3 Tage, ohne Ausnahme.
• Die Serumkonzentration hat sich geändert. Mehr Serum bindet mehr Wirkstoff und erhöht die erforderliche wirksame Konzentration.
• Zeocin im falschen Medium. Hoher Salzgehalt oder ein pH-Wert oberhalb von etwa 7.5 senkt die Aktivität. Das sieht genau wie eine Unterdosierung aus.
• Die Selektion wurde zu früh begonnen. Lassen Sie nach Transfektion oder Transduktion 24–72 Stunden, damit das Resistenzprotein exprimiert werden kann, bevor Sie das Mittel zugeben. Eine sofortige Zugabe tötet Zellen, die resistent geworden wären.
• Der Resistenzmarker wird schlecht exprimiert. Sterben transfizierte Zellen bei einer Konzentration, die untransfizierte Zellen überleben, liegt der Verdacht auf Promotor-Silencing, einer verkürzten Kassette oder einer internen ribosomalen Eintrittsstelle, die den Marker nur schwach exprimiert.
• Handhabung der Stammlösung. Aliquotieren Sie beim ersten Auftauen, lagern Sie wie vorgegeben — typischerweise bei −30 bis −5 °C und lichtgeschützt für G418, Blasticidin, Zeocin und Puromycin, bei 2–8 °C für Hygromycin B — und vermeiden Sie wiederholte Einfrier-Auftau-Zyklen.