Phenolrot im Zellkulturmedium

Phenolrot, chemisch Phenolsulfonphthalein, ist ein Sulfonphthalein-Farbstoff mit einem Molekulargewicht von 354.4 als freie Säure und 376.4 als Natriumsalz, wie es in Medienformulierungen verwendet wird. Es ist aus einem einzigen Grund in den meisten klassischen Zellkulturmedien enthalten: Es ist ein pH-Indikator, dessen Umschlagbereich zufällig genau den pH-Bereich umspannt, in dem Säugerzellen kultiviert werden.

Es lohnt sich, klarzustellen, was es nicht ist. Phenolrot ist kein Puffer. Bei den 5-15 mg/L, die in Medien vorkommen, liegt es in etwa 13-40 mikromolar vor, gegenüber 24-44 millimolar Natriumbicarbonat — drei Größenordnungen weniger. Zur pH-Stabilität des Mediums trägt es nichts Messbares bei. Es ist eine Anzeige, keine Regelung.

Es ist außerdem kein Nährstoff, kein Zusatz und für Zellen nicht erforderlich. Jedes klassische Medium ist auch in einer phenolrotfreien Fassung erhältlich, und Zellen wachsen darin genauso wie in den gefärbten Varianten. Der Farbstoff existiert allein dafür, dass Forschende im Vorbeigehen am Inkubator in einer Sekunde und ohne etwas zu öffnen erkennen können, ob eine Kultur in die falsche Richtung läuft.

Die Konzentration ist über die Formulierungen hinweg nicht standardisiert. Deshalb bedeutet derselbe Orangeton in verschiedenen Medien etwas leicht Unterschiedliches, und deshalb sieht die Farbe von RPMI nie ganz so aus wie die von DMEM.

Ham's F-12 ist mit 1.2 mg/L der Ausreißer, weshalb F-12 im Vergleich zu DMEM blass und ausgewaschen wirkt und weshalb DMEM/F-12 — die Mischung 1:1 — mit 8.1 mg/L dazwischen liegt. Wenn Sie Farben zwischen Kulturflaschen vergleichen, vergleichen Sie nur Flaschen mit demselben Medium.

Manche ausgewogenen Salzlösungen enthalten Phenolrot, andere nicht. HBSS wird in beiden Formen verkauft; PBS und DPBS werden üblicherweise ohne geliefert.

Phenolrot durchläuft über pH 6.8 bis 8.2 einen allmählichen Übergang von Gelb nach Rot, mit einem pKa, der zwischen etwa 7.7 und 8.0 angegeben wird. Die saure Form hat ihr Absorptionsmaximum nahe 443 nm, die basische Form nahe 570 nm — daher die zwei sehr unterschiedlichen Erscheinungsbilder des Farbstoffs.

Entscheidend ist die Gewohnheit, gegen eine Referenz zu vergleichen. Halten Sie die Kulturflasche vor einen weißen Hintergrund, neben eine Flasche desselben frischen Mediums bei gleicher Temperatur. Eine Farbe, die für sich allein, über zwei verschiedene Medien hinweg oder vor einem farbigen Untergrund beurteilt wird, ist unzuverlässig. Die Tabelle weiter unten gibt die praktische Deutung.

Ein Vorbehalt, bevor Sie auf eine Farbe hin handeln: Sie ist halbquantitativ und sie hinkt hinterher. Eine Kultur kann metabolisch belastet sein, bevor sich das Medium sichtbar verändert, und die Verschiebung, die Sie schließlich sehen, spiegelt die über Stunden angesammelte Säurelast wider, nicht den momentanen Zustand der Zellen. Nehmen Sie die Farbe als Anlass, ins Mikroskop zu schauen, nicht als Diagnose für sich.

Gelb bedeutet sauer, und in der Zellkultur bedeutet sauer fast immer Lactat. Zellen in Kultur betreiben aerobe Glykolyse in hohem Tempo und geben Lactat an das Medium ab; die begleitenden Protonen titrieren den Bicarbonatpuffer nach unten, und sobald der pH-Wert unter etwa 6.8 fällt, liegt der Indikator vollständig in seiner gelben Form vor.

Die häufigen Ursachen, grob nach Häufigkeit geordnet:

Die Kultur ist schlicht dicht. Ein konfluenter oder überkonfluenter Zellrasen oder eine Suspensionskultur nahe ihrer Höchstdichte produziert genug Lactat, um das Medium binnen eines Tages gelb zu färben. Das ist normale Biologie, und die Antwort lautet: füttern oder passagieren. Wird eine Flasche zuverlässig gelb, bevor der nächste geplante Medienwechsel ansteht, säen Sie weniger Zellen aus oder füttern Sie häufiger.

Die Kultur stand zu lange. Erschöpftes Medium über ein Wochenende ist der Klassiker. Die Glucose sinkt, Lactat sammelt sich an, und die Kultur steht so lange im Sauren, dass die Viabilität selbst nach Zugabe frischen Mediums abfällt.

Bakterielle Kontamination. Bakterien säuern das Medium weit schneller an als Säugerzellen und trüben es dabei meist gleichzeitig ein. Das Kennzeichen: Medium, das gestern in Ordnung war, ist heute leuchtend gelb und trüb, oft mit sichtbar beweglichen Partikeln bei hoher Vergrößerung. Verwerfen, keinen Rettungsversuch unternehmen und alles überprüfen, was in derselben Sitzung gehandhabt wurde.

Zu viel CO2 oder das falsche Medium für den Inkubator. Ein für 5% CO2 formuliertes Medium, das bei 10% betrieben wird, ist von Anfang an sauer. Stimmen Sie das Bicarbonat auf die Atmosphäre ab: Medien unter etwa 1.5 g/L Natriumbicarbonat passen zu Umgebungsluft oder 4% CO2, 1.5-2.2 g/L passen zu 5%, und über 3.5 g/L passen zu 10%. DMEM mit 3.7 g/L ist für 10% CO2 formuliert und läuft in einem Inkubator mit 5% gegenüber seinem Auslegungspunkt leicht sauer — was die meisten Labore ohne Weiteres hinnehmen, was man aber wissen sollte, wenn eine Flasche vom ersten Tag an orange aussieht.

Rosa oder Fuchsia bedeutet alkalisch, und in einem bicarbonatgepufferten Medium bedeutet Alkalität nahezu immer, dass CO2 das System verlassen hat. Das Bicarbonat ist noch da; die Kohlensäure, die es ausgeglichen hat, ist als Gas entwichen, und der pH-Wert steigt.

Medium außerhalb des Inkubators. Das ist der mit Abstand häufigste Fehlalarm. Eine zur Laborbank getragene Flasche verliert sofort CO2 und wird binnen Minuten sichtbar rosa. Über die Kultur sagt das nichts aus. Beurteilen Sie die Farbe an Flaschen, die direkt aus dem Inkubator kommen — oder nehmen Sie hin, dass alles, was Sie auf der Laborbank fotografieren, alkalischer aussieht, als es ist.

Der Inkubator liefert kein CO2. Eine leere Gasflasche, ein geschlossenes Ventil, ein defekter Druckminderer oder ein driftender Sensor färbt alle Flaschen im Inkubator gemeinsam rosa. Sind alle Ihre Kulturen auf einmal rosa geworden, verdächtigen Sie den Inkubator vor den Zellen — und prüfen Sie den CO2-Wert mit einem unabhängigen Messgerät, denn ein falsch kalibrierter Sensor meldet den Sollwert, während er nichts liefert.

Die Tür stand offen, oder der Inkubator ist überladen. Häufiges oder langes Öffnen der Tür verhindert, dass der Sollwert wieder erreicht wird. Flaschen weiter vorn werden zuerst rosa.

Lockere Verschlüsse oder das falsche Gefäß. Belüftete Verschlusskappen sind dafür ausgelegt, sich mit der Inkubatoratmosphäre auszugleichen. Eine dicht schließende Kappe auf einem bicarbonatgepufferten Medium im CO2-Inkubator verhindert diesen Ausgleich; eine belüftete Kappe auf einer Kultur an der Laborbank lässt CO2 entweichen. Stimmen Sie die Kappe darauf ab, wo die Kultur steht.

Bicarbonat zu hoch für die Atmosphäre. Das Spiegelbild des sauren Falls: Eine Formulierung mit Earle-Salzen bei 2.2 g/L Bicarbonat oder DMEM bei 3.7 g/L wird in Umgebungsluft rasch alkalisch. Formulierungen mit Hanks-Salzen bei 0.35 g/L sind diejenigen, die den pH-Wert an der Luft halten sollen.

Manche Kontaminanten alkalisieren. Eine Minderheit kontaminierender Organismen hebt den pH-Wert, statt ihn zu senken. Rosa plus Trübung bleibt bis zum Beweis des Gegenteils eine Kontamination.

Zwei Fehlermuster sind wichtig genug, um sie klar zu benennen.

Mykoplasmen erzeugen in der Regel weder einen Farbumschlag noch eine Trübung. Mykoplasmenbefallene Kulturen sehen oft völlig normal aus — klares Medium, erwartete Farbe, wachsende Zellen —, während der Erreger Stoffwechsel, Genexpression und Versuchsergebnisse verändert. Zum Aufspüren von Mykoplasmen taugt die Farbe nicht. Verlässlich ist allein die routinemäßige Testung per PCR oder mit einem eigenen Nachweistest nach festem Zeitplan.

Eine normale Farbe bedeutet nicht, dass das Medium ernährungsphysiologisch noch intakt ist. Glucose kann weitgehend aufgebraucht sein und L-Glutamin kann zu Ammoniak zerfallen, ohne dass sich der Indikator weit bewegt. Phenolrot berichtet über die Protonenbilanz, sonst nichts. Eine Kultur, die farblich in Ordnung aussieht, kann trotzdem hungern.

Es gibt außerdem eine praktische Grenze, die man sich merken sollte: Phenolrot unterscheidet nicht zwischen einer dichten gesunden und einer kontaminierten Kultur. Beide färben das Medium gelb. Welche von beiden vorliegt, sagt Ihnen das Mikroskop, nicht die Farbe.

Phenolrot stört optische Messungen, und das ist der wesentliche Grund, es wegzulassen.

Absorptionstests. Der Farbstoff absorbiert stark nahe 443 nm und nahe 570 nm. Dieses zweite Maximum liegt direkt auf den Messwellenlängen mehrerer gängiger kolorimetrischer Tests — MTT wird üblicherweise bei 570 nm gemessen, der Griess-Test auf Nitrit bei etwa 540 nm —, sodass verbliebenes Phenolrot den Leerwert anhebt und den Messbereich staucht. Selbst wenn der Test einen Medien-Leerwert vorsieht, kostet ein farbiger Hintergrund Empfindlichkeit; und da die Absorption des Farbstoffs selbst pH-abhängig ist, wandert der Hintergrund mit dem Stoffwechselzustand der Vertiefung. Genau dieser Punkt ruiniert Platten unbemerkt: Eine stark und eine schwach arbeitende Vertiefung haben unterschiedliche Hintergründe.

Fluoreszenzmessungen. Phenolrot liefert einen breiten Hintergrund vom grünen bis in den orangen Bereich und kann Signal durch Innerfilter-Effekte löschen. Lebendzellmikroskopie, Fluoreszenztests im Plattenlesegerät und die Durchflusszytometrie von Zellen, die noch Medium mitführen, profitieren alle von phenolrotfreien Formulierungen. Für die Mikroskopie ist ein phenolrotfreies Medium mit HEPES die übliche Wahl, weil es zugleich den pH-Wert auf einem Mikroskoptisch außerhalb einer CO2-Atmosphäre hält.

Arbeiten mit östrogenempfindlichen Zellen. Dazu der nächste Abschnitt.

Biotechnologische Produktion und nachgelagerte Aufarbeitung. Wo ein Medienbestandteil aus einem Produkt entfernt werden muss, ist ein unnötiger Farbstoff ein unnötiges Abreicherungsproblem; phenolrotfreie Formulierungen sind in Produktionsmedien Standard.

Manche massenspektrometrischen und metabolomischen Arbeitsabläufe, in denen der Farbstoff und seine Verunreinigungen als störende Ionen auftauchen.

Das gehört präzise formuliert, weil es vielfach in verstümmelter Form weitergegeben wird.

Berthois, Katzenellenbogen und Katzenellenbogen berichteten 1986, dass Phenolrot-Präparate bei 15-45 mikromolar eine messbare östrogene Wirkung zeigen — genau in dem Bereich, in dem der Farbstoff in Kulturmedien vorliegt. Sie fanden eine Bindung an den Östrogenrezeptor von MCF-7-Zellen des menschlichen Mammakarzinoms mit einer Affinität von etwa 0.001% derjenigen von Estradiol (Kd etwa 2 x 10^-5 M) sowie eine dosisabhängige Stimulation der Proliferation in östrogenrezeptorpositiven MCF-7-Zellen, nicht aber in rezeptornegativen MDA-MB-231-Zellen.

Zwei Jahre später zeigten Bindal und Kollegen mittels HPLC und Lösungsmittelverteilung, dass die Rezeptorbindung und die wachstumsfördernde Wirkung nicht dem Phenolsulfonphthalein selbst zuzuschreiben sind, sondern lipophileren Verunreinigungen in kommerziellen Präparaten — eine davon identifiziert als Bis(4-hydroxyphenyl)[2-(phenoxysulfonyl)phenyl]methan — und dass störende Mengen in vielen handelsüblichen Präparaten vorhanden waren. Verwandte Arbeiten führten auch Effekte auf den Kationentransport auf eine lipophile Verunreinigung zurück.

Die praktische Schlussfolgerung ist in beiden Fällen dieselbe und hängt nicht davon ab, welches Molekül verantwortlich ist: Wenn Sie Östrogenantworten untersuchen oder irgendetwas, das der Signalgebung über den Östrogenrezeptor nachgeschaltet ist, verwenden Sie phenolrotfreies Medium. Die Standardkombination ist phenolrotfreies Medium mit Aktivkohle behandeltem Serum, das sowohl die farbstoffgebundene Aktivität als auch die vom Serum beigesteuerten Steroide entfernt. Die Reinheit einer bestimmten Phenolrot-Charge lässt sich am Arbeitsplatz nicht überprüfen, daher ist es verlässlicher, die Variable zu entfernen, als eine saubere Charge anzunehmen.

Für Zellen ohne Östrogenrezeptor und ohne Interesse an diesem Signalweg ist das kein Grund, das Medium zu wechseln.

Der Verzicht auf Phenolrot kostet Sie das kostenlose, ständige pH-Signal auf einen Blick, und Labore, die umstellen, unterschätzen oft, wie sehr sie sich darauf verlassen haben. Kontaminierte Flaschen fallen später auf, erschöpftes Medium noch später.

Drei Ausgleichsmaßnahmen lohnen sich. Legen Sie den Fütterungsplan fest, statt nach Augenmaß zu füttern, und stützen Sie ihn auf eine Wachstumskurve für diese Linie bei dieser Aussaatdichte. Messen Sie den pH-Wert direkt, wenn es darauf ankommt — ein kalibriertes Messgerät an einem Aliquot verbrauchten Mediums kostet eine Minute. Und führen Sie bei einem langen phenolrotfreien Versuch eine gefärbte Kontrollflasche derselben Linie im selben Zeitplan mit, damit Sie eine optische Referenz dafür haben, wann die ungefärbten Kulturen Aufmerksamkeit brauchen.

Der Zusatz von HEPES in 10-25 mM ist eine häufige Begleitänderung bei phenolrotfreier Arbeit, weil er den pH-Wert außerhalb eines CO2-Inkubators während der Mikroskopie oder längerer Handhabung hält. HEPES ersetzt den Indikator nicht — es sorgt für Stabilität, nicht für Sichtbarkeit — und bringt eigene Überlegungen mit, darunter die Phototoxizität unter Beleuchtung.

Eine letzte Verwechslung sei ausgeräumt: Phenolrot tritt auch in der Mikrobiologie als Indikator in Bouillons zur Kohlenhydratvergärung auf, was eine andere Anwendung in einem anderen Zusammenhang ist. Der Inhalt dieser Seite betrifft Phenolrot als pH-Indikator in Medien für die Säugerzellkultur.