Puromycin zur Selektion von Säugerzellen

Puromycin ist ein Naturstoff aus Streptomyces alboniger. Es wird üblicherweise als Dihydrochlorid geliefert (CAS 58-58-2, Molekulargewicht 544.43; die freie Base liegt bei 471.51), ein blassgelbes bis weißes Pulver, das sich leicht in Wasser löst.

Sein Wirkmechanismus ist ungewöhnlich sauber, und genau deshalb ist es ein bevorzugtes Selektionsantibiotikum. Puromycin ist ein Strukturanalogon des 3'-terminalen Aminoacyl-Adenosins der Tyrosyl-tRNA. Weil es dem Arbeitsende einer beladenen tRNA gleicht, bindet es an die A-Stelle des Ribosoms, und das Peptidyltransferase-Zentrum überträgt die wachsende Peptidkette darauf. An diesem Punkt bricht die Analogie zusammen: In einer echten tRNA ist die Aminosäure über eine Esterbindung gebunden, die hydrolysiert und weitergegeben werden kann, in Puromycin dagegen über eine nicht hydrolysierbare Amidbindung. Das Peptid hängt nun kovalent an einem Molekül, das an der nächsten Elongationsrunde nicht teilnehmen kann, und wird daher als verkürztes, puromycyliertes Fragment vom Ribosom freigesetzt.

Daraus folgen drei Konsequenzen, und jede davon hat praktische Bedeutung:

• Es wirkt sowohl auf prokaryotische als auch auf eukaryotische Ribosomen, ist also in Säugerzellen schon in niedrigen Konzentrationen wirksam.
• Es wirkt schnell. Die Proteinsynthese wird sofort gestört und nicht erst nach langsamer Schadensanhäufung. Nicht resistente Zellen beginnen innerhalb von 24-48 Stunden abzusterben, und die Selektion ist meist innerhalb von 2-5 Tagen abgeschlossen — deutlich schneller als bei G418 oder Zeocin.
• Es wird in niedrigen Konzentrationen eingesetzt, typischerweise 1-2 ug/mL, also rund zwei Größenordnungen unter G418. Das bedeutet weniger osmotische und chemische Belastung der Kultur und eine günstigere Selektion.

Außerhalb der Selektionsarbeit wird dieselbe Chemie in puromycylierungsbasierten Verfahren zur Markierung naszierender Polypeptide genutzt, bei denen ein kurzer Puromycin-Puls aktiv translatierende Ribosomen markiert.

Die Resistenz vermittelt das pac-Gen, das für die Puromycin-N-Acetyltransferase (PAC) codiert, ebenfalls aus Streptomyces alboniger. PAC überträgt eine Acetylgruppe von Acetyl-CoA auf die freie Tyrosinyl-Aminogruppe des Puromycins. Das acetylierte Produkt kann vom Peptidyltransferase-Zentrum nicht mehr angenommen werden und ist damit biologisch inert.

Daraus ergeben sich mehrere praktische Punkte:

• Die Resistenz ist enzymatisch und intrazellulär, sie beruht weder auf einer Pumpe noch auf einer Zielstrukturmutation. Eine Zelle muss genug PAC exprimieren, um den Wirkstoff schneller zu entgiften, als er eintrifft. Dadurch lässt sich die Selektionsstringenz über die Konzentration recht gut einstellen — eine höhere Puromycinkonzentration selektiert tatsächlich auf stärkere Expression der Resistenzkassette und damit auch auf stärkere Expression eines gekoppelten Transgens.
• Das Gen ist klein, rund 600 bp, was in lentiviralen und AAV-Vektoren mit knapper Verpackungskapazität ein echter Vorteil ist. Das ist ein wesentlicher Grund, warum die Puromycinselektion bei lentiviralen shRNA- und CRISPR-Bibliotheken dominiert.
• Die Entgiftung wirkt lokal. Weil PAC-exprimierende Zellen den Wirkstoff verbrauchen, können dichte Kulturen resistenter Zellen benachbarte, nicht resistente Zellen teilweise schützen. Das ist der Mechanismus hinter dem häufigsten Selektionsfehler, der weiter unten besprochen wird.
• In der Literatur wird der Marker unterschiedlich geschrieben — pac, puroR, PuroR — stets ist dieselbe Acetyltransferase gemeint.

Die Puromycinresistenz ist dominant und setzt keinen bestimmten Wirtsgenotyp voraus, anders als manche metabolischen Selektionssysteme (etwa die Selektion über Glutaminsynthetase oder DHFR, die darauf angewiesen sind, dass der Wirt im entsprechenden Stoffwechselweg defizient ist).

Der empfohlene Arbeitsbereich für Säugerzellen liegt bei 0.5-10 ug/mL, und die meisten Zelllinien liegen zwischen 1 und 5 ug/mL. Es gibt keinen universellen Wert, und jede für eine Zelllinie in einer Publikation oder einem Katalog genannte Konzentration ist als Ausgangspunkt für Ihre eigene Abtötungskurve zu behandeln, nicht als direkt übernehmbarer Wert.

Gebräuchliche Ausgangspunkte. Viele adhärente Linien, darunter HEK293 und dessen Derivate, HeLa und NIH/3T3, lassen sich bei etwa 1-2 ug/mL gut selektieren. Viele CHO-Linien liegen in einem ähnlichen Bereich, suspensionsadaptierte Linien in serumfreiem Medium oft bei 5-10 ug/mL. Primärzellen und einige Stammzelllinien sind deutlich empfindlicher und lassen sich bei 0.2-1 ug/mL selektieren. Manche Linien — bestimmte murine Linien und Zellen mit hoher endogener Effluxaktivität — brauchen 10 ug/mL oder mehr. Überprüfen Sie all diese Werte mit einer Abtötungskurve.

Typische Ausgangskonzentrationen nach Zelllinie. Jeder Wert unten ist ein Ausgangspunkt für eine Abtötungskurve und keine direkt zu übernehmende Konzentration. Die berichteten Optima schwanken für dieselbe benannte Linie zwischen Laboren, weil Dichte, Serumgehalt, Medium und Puromycin-Charge das Ergebnis allesamt verschieben.

Zelllinie oder Zelltyp	Typischer Ausgangsbereich	Anmerkungen
HEK293, HEK293T	1-2 ug/mL	Empfindlich; Selektion oft in 2-3 Tagen abgeschlossen
HeLa	1-2 ug/mL	Gutmütig, schnelle Selektion
A549, MCF-7 und viele humane Epithellinien	1-3 ug/mL
NIH/3T3 und viele murine Fibroblastenlinien	2-10 ug/mL	Murine Linien brauchen üblicherweise mehr als humane
CHO, adhärent und in Suspension	5-10 ug/mL	Serumfreie Suspension selektiert oft am unteren Ende
Jurkat und andere lymphoide Suspensionslinien	0.5-2 ug/mL	Häufig unter den empfindlichsten
Primärzellen	0.2-1 ug/mL	Langsames Wachstum verringert die Abtötung; verlängern Sie das Zeitfenster statt die Dosis zu erhöhen
hESC und iPSC	0.2-1 ug/mL	Empfindlich; beginnen Sie am unteren Ende des Bereichs
Linien mit hoher Multidrug-Effluxaktivität	10 ug/mL oder mehr	Puromycin kann aktiv ausgeschleust werden; erwägen Sie ein anderes Mittel

Behandeln Sie einen Wert aus dieser Tabelle oder aus einer beliebigen Publikation als Mitte der Dosisreihe, die Sie testen — nicht als die Antwort.

Was die wirksame Konzentration verschiebt:

• Zelldichte. Das ist die größte Einzelvariable und die am häufigsten übersehene. Eine dichte Kultur verbraucht und verdünnt den Wirkstoff pro Zelle, sodass dieselbe nominelle Konzentration weit weniger wirksam ist. Erstellen Sie die Abtötungskurve bei der Dichte, die Sie für die Selektion tatsächlich verwenden werden.
• Serumgehalt. Serumproteine binden Puromycin in gewissem Umfang, sodass eine Kultur in 10 % FBS in der Regel mehr Wirkstoff braucht als dieselben Zellen in serumfreiem oder serumreduziertem Medium. Wird eine Selektion von serumhaltigem auf serumfreies Medium umgestellt, muss die Konzentration meist nach unten neu optimiert werden.
• Verdopplungszeit. Puromycin tötet Zellen, die translatieren. Langsam wachsende, konfluente oder ruhende Kulturen sterben langsamer und unvollständiger ab; deshalb sollte die Selektion an einer subkonfluenten, aktiv teilenden Kultur beginnen.
• Puromycin-Charge. Die Wirkstärke schwankt zwischen Chargen und nimmt bei Lagerung ab. Führen Sie beim Anbruch einer neuen Charge eine verkürzte Abtötungskurve erneut durch.
• pH-Wert des Mediums. Puromycin ist bei alkalischem pH-Wert weniger stabil. Eine Kultur, die durch schlechte CO2-Regelung alkalisch geworden ist, verliert den Selektionsdruck schneller als erwartet.

Wann die Selektion beginnt. Lassen Sie nach der Transfektion 48-72 Stunden in normalem Wachstumsmedium verstreichen, bevor Sie Puromycin zugeben. Die Zellen brauchen Zeit, um die Resistenzkassette zu exprimieren; eine zu frühe Wirkstoffzugabe tötet erfolgreich transfizierte Zellen, bevor sich PAC angesammelt hat. Nach lentiviraler Transduktion genügen meist 24-48 Stunden, da sich die Expression aus einem integrierten Provirus rasch etabliert.

Eine Abtötungskurve ist ein Dosis-Wirkungs-Versuch, der die niedrigste Konzentration ermittelt, die 100 % der nicht transfizierten Zellen innerhalb des vorgesehenen Selektionszeitraums abtötet. Mehr als das ist nicht sicherer — es erhöht die Wahrscheinlichkeit, echte resistente, aber schwächer exprimierende Klone mitabzutöten, und erzeugt zusätzlichen unspezifischen Stress.

Führen Sie den Versuch an parentalen, nicht transfizierten Zellen genau derselben Linie, Passagenspanne und mit genau dem Medium durch, die Sie für die eigentliche Selektion verwenden werden.

Tag 0 — aussäen

1. Ernten Sie gesunde, subkonfluente parentale Zellen in logarithmischer Wachstumsphase mit einer Lebensfähigkeit über 90 %.
2. Säen Sie eine 24-Well-Platte in einer Dichte aus, die am nächsten Tag etwa 50-70 % Konfluenz erreicht — typischerweise 2-5 x 10^4 Zellen pro Well für eine schnell wachsende adhärente Linie. Säen Sie genug Wells für 8 Konzentrationen in Doppel- oder Dreifachbestimmung aus.
3. Passen Sie die Aussaatdichte an die geplante Selektionsdichte an. Eine an dünn ausgesäten Zellen erstellte Abtötungskurve unterschätzt die auf einer dichten Platte nötige Konzentration.
4. Inkubieren Sie über Nacht in normalem Wachstumsmedium ohne Puromycin, damit die Zellen anheften und die Teilung wieder aufnehmen.

Tag 1 — die Dosisreihe anlegen

5. Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe in vollständigem Wachstumsmedium vor. Eine Standardreihe ist 0 (unbehandelte Kontrolle), 0.25, 0.5, 1, 2, 5, 10 und 20 ug/mL. Bei einer voraussichtlich empfindlichen Zelllinie verschieben Sie die Reihe nach unten (0 bis 5 ug/mL); bei einer voraussichtlich resistenten Linie erweitern Sie sie nach oben.
6. Saugen Sie das Medium in jedem Well ab und ersetzen Sie es durch Medium mit der jeweiligen Puromycinkonzentration. Die wirkstofffreie Kontrolle ist unverzichtbar — sie zeigt Ihnen, ob beobachtetes Absterben auf den Wirkstoff oder auf die Kulturbedingungen zurückgeht.

Tag 2-10 — erhalten und beobachten

7. Ersetzen Sie das Selektionsmedium alle 2-3 Tage durch frisch angesetztes Puromycin in derselben Konzentration. Dieser Schritt wird am häufigsten ausgelassen und macht das Ergebnis ungültig: Puromycin verliert im Medium bei 37 C über einige Tage seine Aktivität, und absterbende Zellen setzen Zelltrümmer und Proteasen frei, die die wirksame Potenz weiter senken.
8. Beurteilen Sie täglich im Phasenkontrast. Halten Sie den Anteil abgerundeter, abgelöster oder schwimmender Zellen in jedem Well fest. Fotografieren Sie, wenn Sie eine Dokumentation wünschen.
9. Führen Sie den Versuch bis zu 10 Tage fort oder bis die unbehandelte Kontrolle konfluent wird und abgebrochen werden muss.

Das Ergebnis ablesen

10. Bestimmen Sie die niedrigste Konzentration, bei der keine lebenden Zellen mehr vorhanden sind, und notieren Sie den Tag, an dem das erreicht wurde. Bei Puromycin ist das meist Tag 2-5.
11. Bestätigen Sie das Ergebnis bei uneindeutigen Wells durch eine Trypanblau-Zählung oder eine Vitalfärbung statt allein durch den Augenschein.
12. Verwenden Sie diese Konzentration für die Selektion. Viele Labore halten etablierte stabile Linien anschließend bei der halben Selektionskonzentration, um den Selektionsdruck ohne dauerhafte starke Belastung aufrechtzuerhalten.

Plausibilitätsprüfungen. Ist die unbehandelte Kontrolle nicht gesund, ist die gesamte Kurve nicht auswertbar — wiederholen Sie sie. Stirbt selbst bei 20 ug/mL nichts, prüfen Sie, ob der Wirkstoff zugegeben wurde, ob die Stammlösung nicht zersetzt ist und ob die Zellen nicht bereits aus früheren Arbeiten einen Resistenzmarker tragen. Stirbt alles einschließlich der Kontrolle, sehen Sie sich Medium, Platte und Inkubator an, bevor Sie den Wirkstoff verantwortlich machen.

Zeitpunkt. Geben Sie Puromycin 48-72 Stunden nach der Transfektion oder 24-48 Stunden nach der Transduktion zu. Nicht resistente Zellen sollten innerhalb von 24-48 Stunden sichtbar absterben und bis Tag 3-5 weitgehend verschwunden sein.

Wirkstoff erneuern. Wechseln Sie das Selektionsmedium durchgehend alle 2-3 Tage. Das erhält nicht nur die Potenz, sondern entfernt auch die großen Mengen Zelltrümmer aus dem massenhaften Zelltod, die sonst überlebende Kolonien ersticken.

Abtötungskontrolle mitführen. Führen Sie zu jeder Selektion nicht transfizierte parentale Zellen in Puromycin parallel mit. Sind diese vollständig abgestorben, ist der Selektionsdruck für genau dieses Experiment belegt. Ohne diese Kontrolle ist eine Platte mit überlebenden Zellen uneindeutig — sie können resistent sein, oder der Wirkstoff hat schlicht versagt.

Die Dichte ist die übliche Fehlerquelle. Weil PAC-exprimierende Zellen Puromycin zerstören, schafft eine dichte Population resistenter Zellen lokale Zonen, in denen die Wirkstoffkonzentration so weit abfällt, dass nicht resistente Zellen überleben. Die Symptome sind ein Hintergrundrasen nicht transfizierter Zellen, der nicht verschwindet, und Kolonien, die nicht sauber auswachsen. Abhilfe schafft es, die Kultur während der Selektion subkonfluent zu halten, bei zunehmender Dichte unter Beibehaltung des Wirkstoffs zu passagieren und das Medium häufig zu wechseln.

Erwartete Dauer. Die Selektion ist meist in 3-7 Tagen abgeschlossen. Wenn Sie Klone isolieren, halten Sie den Selektionsdruck über die Kolonieexpansion hinweg aufrecht. Bei gepoolten Populationen kann der Pool expandiert werden, sobald die Abtötungskontrolle vollständig frei ist.

Erhaltung. Etablierte stabile Linien werden häufig bei der halben Selektionskonzentration gehalten oder zyklisch geführt — ohne Wirkstoff kultiviert und periodisch in die Selektion zurückgesetzt —, um chronischen Stress zu verringern. Zelllinien können integrierte Kassetten mit der Zeit stilllegen; überprüfen Sie die Expression daher regelmäßig, statt anzunehmen, dass fortgesetzte Selektion sie garantiert.

Eine Warnung zur Deutung des Überlebens. Puromycin selektiert auf Zellen, die PAC exprimieren. Es selektiert nicht auf die Expression dessen, was sonst noch auf Ihrem Konstrukt liegt. Die Stilllegung eines nachgeschalteten Transgens bei weiterhin aktivem Resistenzmarker ist häufig, besonders bei schwachen internen Promotoren oder IRES-gekoppelten Kassetten. Bestätigen Sie die Expression des Gens, auf das es Ihnen ankommt, immer mit einem unabhängigen Nachweis.

Ansetzen der Stammlösung. Puromycin-Dihydrochlorid ist leicht wasserlöslich. Die Standardstammlösung ist 10 mg/mL in sterilem Wasser oder in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung, sterilfiltriert über 0.22 um. Fertige Lösungen zu 10 mg/mL sind breit verfügbar und ersparen das Einwiegen eines gefährlichen Pulvers.

Der pH-Wert zählt. Puromycin ist in leicht saurer bis neutraler Lösung am stabilsten, etwa bei pH 6.0-7.0, und zersetzt sich unter alkalischen Bedingungen merklich. Setzen Sie die Stammlösung nicht in einem alkalischen Puffer an und lagern Sie sie nicht in Medium, das durch CO2-Verlust alkalisch geworden ist.

Lagerung.

• Pulver: -20 C, trocken und lichtgeschützt.
• Wässrige Stammlösung zu 10 mg/mL: -20 C, lichtgeschützt, in Einwegaliquots. Unter diesen Bedingungen etwa ein Jahr stabil.
• Kurzfristige Gebrauchslösung: 2-8 C für bis zu etwa einen Monat.
• Wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden. Jeder Zyklus kostet Wirkstärke, und eine ein Dutzend Mal aufgetaute Stammlösung ist eine häufige verborgene Ursache misslungener Selektionen. Aliquotieren Sie beim ersten Auftauen zu 100-500 uL.

Im Kulturmedium. Puromycin verliert im vollständigen Medium bei 37 C über einige Tage seine Aktivität. Das ist der Grund für den Mediumwechsel alle 2-3 Tage während Selektion und Abtötungskurve. Setzen Sie keinen großen Vorrat an Selektionsmedium an, um ihn über zwei Wochen zu verbrauchen.

Licht. Schützen Sie Stammlösungen vor längerer Lichteinwirkung. Das Einwickeln der Röhrchen in Alufolie genügt.

Handhabung. Puromycin ist ein Proteinsyntheseinhibitor und toxisch. Handhaben Sie das Pulver im Abzug oder in der Sicherheitswerkbank mit Handschuhen und Augenschutz, um kein Staubaerosol einzuatmen, und entsorgen Sie Lösungen als Chemieabfall. Das Abmessen einer Fertiglösung ist dem Umgang mit dem Pulver überall dort vorzuziehen, wo es möglich ist.

Puromycin ist bei den meisten Arbeiten an stabilen Linien die Standardwahl, weil es schnell und günstig ist, schon in niedriger Konzentration wirkt und von einem kleinen Gen getragen wird. Es ist aber nicht immer die richtige Wahl.

Greifen Sie zu Puromycin, wenn Sie die kürzestmögliche Selektion wollen, wenn Sie mit einem viralen Vektor arbeiten, bei dem die Insertgröße begrenzt ist, oder wenn Sie eine gepoolte Bibliothek selektieren, bei der Schnelligkeit die Drift verringert.

Greifen Sie zu etwas anderem, wenn:

• Sie einen zweiten oder dritten Marker brauchen. Eine aufeinanderfolgende oder gleichzeitige Selektion auf mehrere Konstrukte erfordert orthogonale Wirkstoffe — Puromycin plus Blasticidin plus Hygromycin ist ein gängiges Trio, da sich ihre Resistenzmechanismen nicht überschneiden.
• Ihre Zelllinie von Natur aus puromycinresistent ist oder eine so hohe Konzentration verlangt, dass unspezifische Toxizität zum Problem wird.
• Sie eine sehr stringente, langsame Selektion auf stark exprimierende Klone brauchen. Die Selektion mit G418 verläuft langsamer, und manche Arbeitsgruppen finden, dass sie gerade deshalb stabile Hochexprimierer besser anreichert.
• Sie mit Zellen arbeiten, die eine hohe Multidrug-Effluxaktivität besitzen, bei denen Puromycin aktiv ausgeschleust werden kann.

Eine Anmerkung zu Zeocin, das sich von den übrigen unterscheidet: Es ist ein DNA-spaltendes Glykopeptid und kein Translationshemmer, es benötigt für volle Aktivität ein salzarmes Medium bei pH 7.0-7.5, und es ist stark lichtempfindlich. Eine misslungene Zeocin-Selektion ist sehr oft ein Problem der Mediumzusammensetzung und keines der Dosis.

Welchen Wirkstoff Sie auch einsetzen, die Anforderung an die Abtötungskurve bleibt dieselbe. Jeder Wirkstoff, jede Zelllinie, jede neue Charge.