DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)

DMEM wurde 1959 von Renato Dulbecco und Gordon Freeman als Abwandlung des Mediums von Harry Eagle für Plaque-Assays mit dem Polyomavirus beschrieben. Die Änderung war bewusst schlicht: Eagles Formulierung nehmen und eine „vierfache Konzentration an Aminosäuren und Vitaminen" einsetzen. Eagles eigenes Minimal Essential Medium, im selben Jahr veröffentlicht, hatte bereits festgelegt, welchen Mindestsatz an Nährstoffen eine Säugerzelle in Kultur braucht — dreizehn essenzielle Aminosäuren, acht Vitamine, Glucose und die sechs anorganischen Salze der Earle-Salzlösung.

Diese Konzentrationen anzuheben war deshalb wichtig, weil Eagles MEM minimal angelegt war. Kulturen verbrauchten es rasch und mussten häufig gefüttert werden. Die Vervierfachung von Aminosäuren und Vitaminen ergab ein Medium, das zwischen zwei Fütterungen höhere Zelldichten trägt — genau das, was ein Virologe braucht, der über mehrere Tage Plaques auszählt.

Modernes kommerzielles DMEM ist nicht in jedem Bestandteil buchstäblich 4× MEM. Die Hersteller ergänzten Glycin, Serin und Eisen(III)-nitrat und verschoben das Salzgleichgewicht: Das Natriumhydrogencarbonat stieg von 2200 auf 3700 mg/L, und das Natriumchlorid sank von 6800 auf 6400 mg/L, um das osmotisch auszugleichen. Was heute als „DMEM" verkauft wird, ist ein stabiler, gut charakterisierter Standard — aber ein kommerzieller Standard und nicht die wörtliche Rezeptur von 1959.

Dies sind die beiden meistgenutzten Basalmedien der Zellkultur, und die Frage, welches zu wählen ist, stellt sich ständig. Sie sind nicht austauschbar, und die Unterschiede sind struktureller, nicht kosmetischer Natur.

Die Entscheidung läuft meist auf drei Fragen hinaus.

Wächst die Kultur adhärent oder in Suspension? Die 1.8 mM Calcium in DMEM unterstützen eine feste Anheftung; die 0.42 mM in RPMI wurden bewusst niedrig gehalten, damit lymphoblastoide Zellen in Suspension bleiben. Adhärente Fibroblasten- und Epithellinien gehören in DMEM, lymphoide und hämatopoetische Suspensionszellen in RPMI.

Was sagt das Referenzprotokoll der Linie? Bei etablierten Linien ist das keine Geschmacksfrage. Ein Wechsel zwischen DMEM und RPMI verändert Verdopplungszeit, Sättigungsdichte und häufig die Proteinexpression und macht damit den Vergleich mit der publizierten Literatur ungültig, solange Sie die Linie danach nicht neu charakterisieren.

Wie hoch ist der Stoffwechselbedarf der Kultur? DMEM mit 25 mM Glucose und etwa der vierfachen Aminosäurekonzentration von RPMI ist für dichte, schnelle, anspruchsvolle Kulturen ausgelegt. RPMI ist für Zellen gebaut, die über Tage mit mittlerer Rate wachsen, und dichte Kulturen erschöpfen es früher.

Keines der beiden Medien ist schlicht reicher als das andere. DMEM gewinnt bei Aminosäuren und Glucose, RPMI bei den Vitaminen, der Phosphatpufferung und seinem ungewöhnlichen Gehalt an reduziertem Glutathion.

Die folgende Tabelle zeigt die Standardformulierung des glucosereichen DMEM (die bei allen großen Herstellern verwendete Referenzformulierung, entsprechend Gibco 11965 und Produkten der Klasse Sigma D5796). Glucosearmes DMEM ist damit identisch, abgesehen davon, dass D-Glucose mit 1000 mg/L statt mit 4500 mg/L enthalten ist.

Anorganische Salze und Hauptbestandteile

Aminosäuren (mg/L)

Glycin 30; L-Arginin·HCl 84; L-Cystin·2HCl 63; L-Histidin·HCl·H2O 42; L-Isoleucin 105; L-Leucin 105; L-Lysin·HCl 146; L-Methionin 30; L-Phenylalanin 66; L-Serin 42; L-Threonin 95; L-Tryptophan 16; L-Tyrosin-Dinatriumsalz-Dihydrat 104; L-Valin 94.

Vitamine (mg/L)

Cholinchlorid 4; D-Calciumpantothenat 4; Folsäure 4; Niacinamid 4; Pyridoxin·HCl 4; Thiamin·HCl 4; i-Inositol 7.2; Riboflavin 0.4.

Beachten Sie, was fehlt. DMEM enthält außer Glycin und Serin keine nichtessenziellen Aminosäuren — kein Alanin, kein Asparagin, kein Aspartat, kein Glutamat, kein Prolin. Es enthält keine Nukleoside, kein Biotin, kein Vitamin B12 und keine Liponsäure. Das einzige Spurenmetall ist eine symbolische Menge Eisen(III)-nitrat. Alles Weitere, was eine Zelle braucht, soll aus dem Serum kommen. Das ist die wichtigste strukturelle Tatsache über DMEM: Es ist eine an Aminosäuren und Vitaminen reiche Basis, gebaut auf der Annahme, dass Serum Lipide, Spurenelemente, Trägerproteine und Wachstumsfaktoren liefert.

Die beiden Glucosestufen sind keine austauschbaren Voreinstellungen, und die Wahl aus Gewohnheit ist eine häufige Quelle nicht reproduzierbarer Daten.

Glucosereich (4500 mg/L, 25 mM) entspricht etwa dem Fünffachen des physiologischen Blutzuckers. Verwenden Sie es für schnell wachsende transformierte Linien, für transiente Transfektion und Virusproduktion in HEK293, für Hybridome und für jede Kultur, die Sie ohne häufiges Füttern zu hoher Dichte treiben wollen. Die zusätzliche Glucose wirkt als Nährstoffreservoir. Der Preis dafür: Zellen bei 25 mM Glucose stützen sich stark auf die Glykolyse, säuern das Medium durch Lactatanreicherung schneller an und können einen glykolytischen Phänotyp zeigen, der ein Artefakt des Mediums und nicht der untersuchten Biologie ist.

Glucosearm (1000 mg/L, 5.6 mM) liegt nahe am normalen humanen Blutzucker. Verwenden Sie es für primäre Hepatozyten, für mesenchymale Stromazellen, bei denen hohe Glucose dokumentierte Auswirkungen auf die Differenzierung hat, für Langzeit- und Differenzierungskulturen sowie für jede Stoffwechselstudie, in der die Glykolyse nicht auf Anschlag laufen soll. Glucosearmes DMEM ist auch die passendere Wahl, wenn Sie oxidativen und glykolytischen Stoffwechsel vergleichen, denn 25 mM Glucose unterdrücken in vielen transformierten Linien über den Crabtree-Effekt die oxidative Phosphorylierung.

Glucosefreies DMEM gibt es aus demselben Grund: Sie legen die Kohlenstoffquelle selbst fest, ersetzen die Glucose durch Galaktose, um den oxidativen Stoffwechsel zu erzwingen (ein Standardvorgehen im Screening auf mitochondriale Toxizität), oder titrieren die Glucose auf einen definierten Wert.

Wenn Sie eine etablierte Kultur zwischen den Glucosestufen umstellen, tun Sie das schrittweise und erheben Sie die Wachstumskurve neu. Verdopplungszeit, Konfluenz beim Passagieren und Transfektionseffizienz verschieben sich alle.

Die meiste Verwirrung beim Bestellen von DMEM entsteht durch vier unabhängige Optionen, die die Hersteller frei kombinieren.

Glutamin. L-Glutamin mit 4 mM ist Standard, zerfällt aber in Lösung — es cyclisiert zu Pyrrolidoncarbonsäure und setzt Ammoniak frei, mit einer Halbwertszeit von wenigen Wochen bei 4 °C und deutlich kürzer bei 37 °C. Glutaminfreies DMEM erlaubt es, das Glutamin frisch bei Gebrauch zuzugeben oder es durch die Dipeptidform (L-Alanyl-L-Glutamin) zu ersetzen, die in Lösung stabil ist und Glutamin langsam freisetzt, sobald die Zellen sie spalten. Für alles, was länger als eine Woche ohne vollständigen Medienwechsel kultiviert wird, ist das Dipeptid die bessere technische Wahl.

Natriumpyruvat. Mit 1 mM liefert Pyruvat ein zusätzliches Energiesubstrat und einen kleinen antioxidativen Vorteil. Für Zellen bei niedriger Dichte oder niedrigem Serumanteil ist es wirklich nützlich, weil es die Plattierungseffizienz verbessert. Lassen Sie es weg, wenn Sie metabolische Flussanalysen durchführen, bei denen ein unmarkierter Pyruvatpool die Auswertung der Markierung erschwert.

Phenolrot. Ein pH-Indikator mit 15 mg/L, kein Nährstoff. Entfernen Sie es, wenn es Ihr Messsignal stört — Fluoreszenz- und Absorptionsmessungen im Bereich 550–600 nm, Durchflusszytometrie — und denken Sie daran, dass Phenolrot eine schwache östrogene Wirkung hat, was für hormonempfindliche Linien wie MCF-7 von Bedeutung ist.

HEPES. Meist 10–25 mM, zugesetzt, um den pH-Wert bei Arbeiten außerhalb des Inkubators zu stabilisieren. HEPES puffert gut im Bereich pH 7.2–7.4 und ist nicht auf CO2 angewiesen. Der Nachteil ist real: HEPES wirkt unter Licht phototoxisch, weil dabei Wasserstoffperoxid entsteht, und bei 25 mM ist es für manche Primär- und Stammzellkulturen zytotoxisch. Setzen Sie es ein, wenn Ihr Protokoll längere Zeiten auf der Werkbank vorsieht, nicht als Voreinstellung.

DMEM/F-12 ist eine 1:1-Mischung aus DMEM und Ham's F-12 und für alle, die den Serumanteil senken wollen, das Nützlichste in der DMEM-Familie.

Ham's F-12, 1965 von Richard Ham veröffentlicht, wurde als chemisch definiertes Medium für klonales Wachstum entworfen und ist ernährungsphysiologisch das Gegenteil von DMEM: moderate Aminosäurekonzentrationen, dafür aber ein breites Spektrum an Bestandteilen, die DMEM fehlen — Spurenelemente (Zink, Kupfer, Eisen als Eisen(II)-sulfat), Lipidvorstufen (Linolsäure, Liponsäure, Putrescin), Nukleosidvorstufen (Hypoxanthin, Thymidin) und zusätzliche Vitamine (Biotin, B12). Die Mischung beider ergibt eine Basis mit den Nährstoffkonzentrationen von DMEM und der Breite von F-12.

Die Standardformulierung von DMEM/F-12 enthält 3151 mg/L Glucose (17.5 mM), 2438 mg/L Natriumhydrogencarbonat (29 mM), 116.6 mg/L Calciumchlorid, 55 mg/L Natriumpyruvat (0.5 mM), 365 mg/L L-Glutamin (2.5 mM) und 8.1 mg/L Phenolrot sowie die Spurenelemente aus F-12 in halber F-12-Konzentration. Eine weit verbreitete HEPES-Variante ergänzt 15 mM HEPES und senkt das Hydrogencarbonat auf etwa 1200 mg/L.

DMEM/F-12 ist die Standardbasis für serumfreie und serumreduzierte Formulierungen, für die Kultur von Keratinozyten und Epithelzellen, für neurale Stammzellen (mit N-2- oder B-27-Zusatz) sowie für Hybridom- und iPSC-Arbeiten. Wenn Sie in einem DMEM-basierten Prozess den Serumanteil senken wollen, ist der Wechsel der Basis auf DMEM/F-12 meist der erste ertragreiche Schritt, weil die Spurenelemente und Lipidvorstufen, die das Serum stillschweigend geliefert hat, bereits im Medium enthalten sind.

Der Arbeits-pH-Wert von DMEM liegt bei 7.2 ± 0.2, der Standardspezifikation des Mediums und dem Bereich, in dem die meisten Säugerzellen kultiviert werden. Dieser Wert bezieht sich auf vollständiges Medium, das in seiner vorgesehenen CO2-Atmosphäre äquilibriert wurde — nur unter dieser Bedingung sagt die Zahl überhaupt etwas aus.

DMEM wird über das Hydrogencarbonat/CO2-System gepuffert. Gelöstes CO2 bildet Kohlensäure, die zu Hydrogencarbonat und einem Proton dissoziiert; der pH-Wert ergibt sich aus dem Verhältnis von Hydrogencarbonatkonzentration zu CO2-Partialdruck. Daraus folgt: Hydrogencarbonatgehalt im Medium und CO2-Gehalt im Inkubator sind ein aufeinander abgestimmtes Paar.

Deshalb sagt die pH-Messung an einer Flasche direkt aus dem Kühlschrank sehr wenig aus. Außerhalb einer CO2-Atmosphäre verliert das Medium gelöstes CO2 und misst alkalisch — häufig 7.6 oder darüber — und kehrt im Inkubator binnen ein bis zwei Stunden in die Spezifikation zurück. Wenn Sie einen aussagekräftigen Messwert brauchen, äquilibrieren Sie zuerst ein Aliquot mit gelockertem Deckel im Inkubator oder verwenden Sie eine HEPES-gepufferte Formulierung, deren pH-Wert gar nicht von CO2 abhängt.

Die 3700 mg/L (44 mM) Hydrogencarbonat in DMEM wurden für 10% CO2 formuliert, nicht für 5%. Das ist die am häufigsten übergangene Tatsache über dieses Medium. Bei 5% CO2 liegt das Hydrogencarbonat im Überschuss vor und das Medium ist alkalisch, typischerweise pH 7.6–7.8 unmittelbar nach dem Einstellen in den Inkubator, sichtbar rosa bis violett. Die meisten Labore betreiben DMEM dennoch bei 5% CO2 und kommen damit durch, weil stoffwechselnde Zellen Lactat und CO2 bilden, die den pH-Wert binnen Stunden wieder senken. Eine frisch angeimpfte Flasche bei niedriger Dichte hat diese Korrektur jedoch nicht, und die Plattierungseffizienz leidet. Wenn Sie bei 5% CO2 kultivieren und das Medium dauerhaft violett bleibt, wechseln Sie entweder auf 10% CO2, verwenden Sie eine Formulierung mit reduziertem Hydrogencarbonat oder setzen Sie HEPES zu.

Das umgekehrte Problem — gelb werdendes Medium — ist schlicht Ansäuerung. Phenolrot ist unterhalb von etwa pH 6.8 gelb. Überwachsen, hohe Glucose mit entsprechender Lactatbildung, eine leere oder undichte CO2-Versorgung oder eine bakterielle Kontamination führen alle dazu. Gelbes Medium in einer gestern angeimpften Flasche, die unter dem Mikroskop spärlich aussieht, spricht eher für Kontamination als für Stoffwechsel.

Da Hydrogencarbonat als CO2 entweicht, sobald eine Flasche bei Atmosphärendruck offen steht, wird auf der Werkbank stehendes Medium langsam alkalisch. Das ist normal und kehrt sich im Inkubator um. Es ist ein Grund, die Zeit mit offener Flasche kurz zu halten, kein Grund, die Flasche zu verwerfen.

DMEM ist die Standardbasis für adhärente, verankerungsabhängige Zellen: HEK293 und seine Abkömmlinge, HeLa, NIH/3T3 und andere Fibroblastenlinien, COS-7, Vero, MDCK, C2C12-Myoblasten, primäre Fibroblasten, glatte Muskelzellen und Endothelzellen (üblicherweise mit zusätzlichen Ergänzungen) sowie adhärente CHO. Typisch sind 10% fötales Kälberserum oder 5–10% Kälberserum von Neugeborenen für robustere Linien.

Der hohe Calciumgehalt von DMEM (1.8 mM) ist ein echtes Auswahlkriterium und keine Fußnote. Calcium in dieser Höhe fördert die Cadherin-vermittelte Zell-Zell-Adhäsion und treibt die Differenzierung von Keratinozyten an; Keratinozyten- und manche Epithelprotokolle schreiben deshalb eine calciumarme Basis vor. Umgekehrt gedeihen Zellen, die eine feste Anheftung brauchen, in DMEM besser als in RPMI, dessen Calciumgehalt nur bei etwa 0.4 mM liegt.

Als erste Wahl für lymphoide Suspensionskulturen taugt DMEM wenig — für die meisten humanen Leukämie- und Lymphomlinien, für PBMC und für Hybridome bei niedriger Dichte ist RPMI 1640 die etablierte Basis. Ebenso wenig ist es das Medium für klonales Wachstum bei sehr niedriger Dichte ohne Serum; dafür wurden Ham's F-12 und DMEM/F-12 gebaut.

Serum. 10% FBS sind Standard. Die Hitzeinaktivierung (56 °C, 30 min) ist bei komplementempfindlichen Arbeiten üblich, aber nicht generell nötig und baut einige Wachstumsfaktoren ab; entscheiden Sie bewusst und nicht aus Gewohnheit.

Gängige Zusätze. Nichtessenzielle Aminosäuren mit 1x (aus 100x Stammlösung) lohnen sich in jeder DMEM-Kultur mit reduziertem Serumanteil, weil der eigene Gehalt von DMEM an nichtessenziellen Aminosäuren auf Glycin und Serin beschränkt ist. Natriumpyruvat mit 1 mM, sofern nicht bereits enthalten. Penicillin/Streptomycin nur dort, wo es wirklich nötig ist — routinemäßige Antibiotika verdecken eine geringgradige Kontamination und verändern das Mykoplasmenrisiko.

Lagerung. Flüssiges DMEM wird bei 2–8 °C lichtgeschützt gelagert und ist in der Regel über die aufgedruckte Haltbarkeit stabil (üblicherweise 12–24 Monate ungeöffnet). Nach Zugabe von Glutamin rechnen Sie mit einer Gebrauchsdauer von etwa vier Wochen bei 2–8 °C. Riboflavin, Folsäure, Tryptophan und HEPES sind alle lichtempfindlich; Medium unter Laborbeleuchtung stehen zu lassen erzeugt Wasserstoffperoxid und Abbauprodukte, die die Plattierungseffizienz senken. Lagern Sie Flaschen im Dunkeln, nicht auf einem offenen Regal.

Erwärmen. Erwärmen Sie nur das Aliquot, das Sie brauchen. Eine 500 mL Flasche wiederholt auf 37 °C zu bringen, beschleunigt den Glutaminabbau und den Hydrogencarbonatverlust. Für die meisten Arbeiten genügt Raumtemperatur; das Medium muss nicht 37 °C erreichen, bevor es auf die Zellen kommt.

DMEM als Pulvermedium ist im großen Maßstab die wirtschaftliche Option, wird aber ohne Natriumhydrogencarbonat geliefert. Dieses muss beim Ansetzen zugegeben werden (3.7 g/L für die Standardformulierung), der pH-Wert wird etwa 0.1–0.2 Einheiten unter den Zielwert eingestellt, um den Anstieg während der Filtration auszugleichen, und die Lösung wird durch 0.22 µm sterilfiltriert. Verwenden Sie endotoxinarmes Wasser mit einem spezifischen Widerstand von mindestens 18.2 MΩ·cm.

Weil DMEM mit Phenolrot versetzt und klar ist, meldet es seinen eigenen Zustand besser als die meisten Reagenzien. Es lesen zu lernen rettet Inkubatoren.

Bakterielle Kontamination. Das Medium wird rasch gelb — oft über Nacht — und sichtbar trüb. Unter dem Mikroskop sehen Sie kleine bewegliche oder lichtbrechende Partikel zwischen den Zellen und bei höherer Dichte ein schimmerndes Korn. Die diagnostische Kombination lautet gelb plus trüb plus spärliche oder frisch angeimpfte Kultur: Stoffwechsel allein kann eine Flasche mit wenigen Zellen nicht so ansäuern.

Hefekontamination. Trübung mit sichtbaren ovalen, knospenden Partikeln, meist mit langsamerem pH-Abfall als bei Bakterien. Tritt häufig als abgegrenzte Nester und nicht als gleichmäßige Trübung auf.

Pilz- oder Schimmelkontamination. Sichtbare fadenförmige Strukturen, mitunter eine mit bloßem Auge erkennbare, flauschig schwimmende Kolonie. Der pH-Wert kann eine Zeit lang nahezu normal bleiben, sodass Schimmel bei einer reinen Farbkontrolle übersehen werden kann.

Mykoplasmen. Die gefährliche Variante, denn sie erzeugen keine Trübung, keinen Farbumschlag und keinen im gewöhnlichen Lichtmikroskop sichtbaren Organismus. Die Kulturen sehen normal aus, während die Wachstumsrate sinkt, die Sättigungsdichte fällt und die Versuchsergebnisse abdriften. Mykoplasmen lassen sich nicht durch Betrachten des Mediums nachweisen — dafür braucht es PCR, einen lumineszenzbasierten Enzymassay oder eine DNA-Färbung, und genau deshalb ist eine regelmäßige Testung Pflicht und keine Kür.

Was keine Kontamination ist. Medium, das nach dem Stehen auf der Werkbank violett wird, hat Hydrogencarbonat verloren, keine Infektion. Medium, das in einer konfluenten, vor drei Tagen gefütterten Flasche gelb wird, ist normaler Stoffwechsel. Ein feiner kristalliner Niederschlag nach einem Kalt-Warm-Zyklus ist meist ausfallendes Calciumphosphat und kein mikrobielles Wachstum.

Das Risiko senken. Aliquotieren Sie das Medium in Arbeitsvolumina, damit ein einzelner Kontaminationsfall nicht eine ganze Flasche kostet. Geben Sie abgegossenes Medium nie in die Vorratsflasche zurück. Setzen Sie Antibiotika bewusst ein — routinemäßiges Penicillin/Streptomycin drückt eine geringgradige bakterielle Kontamination in einen unsichtbaren chronischen Zustand und wirkt gar nicht gegen Mykoplasmen, kann also genau das Problem verbergen, das es zu lösen scheint.

Bei Stoffwechselarbeiten voreingestellt glucosereiches DMEM verwenden. 25 mM Glucose sind eine pharmakologische und keine physiologische Konzentration, und sie verändern den Stoffwechselphänotyp.

DMEM für ein vollständiges Medium halten. Ist es nicht. Ohne Serum oder einen eigens entworfenen Zusatz fehlen DMEM Lipide, Spurenelemente, Transferrin und Wachstumsfaktoren.

Das Missverhältnis zwischen Hydrogencarbonat und CO2 ignorieren. Siehe oben; das kostet in vielen Laboren still und leise Plattierungseffizienz.

DMEM/F-12 und DMEM austauschbar verwenden. Sie unterscheiden sich in Glucose, Calcium, Hydrogencarbonat, Osmolalität und Spurenelementgehalt. Daten aus dem einen lassen sich nicht auf das andere übertragen.

Glutamin in eine Flasche geben und das Datum vergessen. Beim Glutaminzerfall entsteht Ammoniak, der toxisch ist und sich anreichert. Beschriften Sie die Flasche im Moment der Zugabe.

Serumhaltiges Medium durch die falsche Membran sterilfiltrieren. Protein bindet und verstopft; verwenden Sie eine proteinarm bindende Membran und einen Vorfilter.

Auf einem beleuchteten Regal lagern. Der Lichtabbau von Riboflavin und HEPES ist eine reale und messbare Quelle von Zytotoxizität.