Dispase

Dispase ist eine neutrale Protease, die aus Kulturfiltraten von Paenibacillus polymyxa gewonnen wird (in der älteren Literatur als Bacillus polymyxa bezeichnet). Sie ist als EC 3.4.24.4, CAS 9001-92-7 geführt und hat eine Molekülmasse von etwa 35900 Da. „Dispase II“ bezeichnet die üblicherweise gelieferte Qualitätsstufe und nicht ein anderes Enzym.

Strukturell ist sie eine Metalloprotease, die pro Untereinheit ein Zinkion und vier Calciumionen bindet. Das Zink ist katalytisch – entfernt man es mit einem Chelatbildner, bleibt ein inaktives Apoenzym zurück. Das Calcium ist strukturell: Es erhält die Faltung und schützt das Enzym vor Autolyse. Beides hat unmittelbare praktische Folgen, die weiter unten behandelt werden, und beides ist der wichtigste Unterschied in der Handhabung gegenüber Trypsin.

Ihr Substratprofil ist der Grund, weshalb sie als eigenes Produkt existiert und nicht bloß eine weitere allgemeine Protease ist. Stenn und Kollegen charakterisierten sie 1989 und zeigten, dass Dispase Fibronektin und Kollagen Typ IV spaltet, nicht aber Laminin, Kollagen Typ V, Serumalbumin oder Transferrin. Kollagen Typ I wird nur minimal abgebaut, und die Wirkung auf Kollagen Typ IV erzeugt mehrere stabile Abbauprodukte statt eines vollständigen Verdaus.

Kollagen Typ IV und Fibronektin sind Bestandteile der Basalmembran. Laminin, das Dispase unangetastet lässt, ist ein weiterer. In der Praxis bedeutet das: Dispase greift die Schicht zwischen einem Epithel und dem darunterliegenden Bindegewebe an und lässt die Verbindungen der Epithelzellen untereinander weitgehend unberührt. Das ist eine sehr spezifische und nützliche Fähigkeit – sie trennt Gewebe an der Basalmembran und hebt Zellverbände ab, statt sie in Einzelzellen aufzulösen.

Da sie bakteriellen Ursprungs ist, ist Dispase frei von tierischen Bestandteilen, was in regulierten Arbeitsabläufen wichtig ist, in denen Trypsin aus Schweinepankreas ein Problem darstellt.

Die Aktivität von Dispase ist über einen Caseinverdau definiert: Eine Einheit ist die Enzymmenge, die pro Minute bei 37 °C und pH 7.5 mit Casein als Substrat Folin-positive Aminosäuren freisetzt, die 1 Mikromol Tyrosin entsprechen.

Die spezifische Aktivität handelsüblicher Dispase schwankt erheblich mit Qualitätsstufe und Charge. Ein teilgereinigtes Präparat kann mit etwa 1.2 Einheiten/mg spezifiziert sein, ein höherwertiges Produkt mit 4 Einheiten/mg oder mehr – ein Unterschied um den Faktor drei oder mehr an Enzymaktivität bei gleicher Pulvermasse.

Das ist der wichtigste praktische Punkt zu Dispase und die Stelle, an der Protokolle am häufigsten nicht von einem Labor auf ein anderes übertragbar sind. Ein Protokoll, das „1 mg/mL Dispase“ angibt, ist nicht reproduzierbar, solange es nicht auch die spezifische Aktivität der verwendeten Charge nennt. 1 mg/mL im einen Labor entspricht enzymatisch 3 mg/mL im anderen. Gibt eine veröffentlichte Methode die Konzentration in Einheiten pro Milliliter an, dosieren Sie in Einheiten; steht dort Milligramm, prüfen Sie das Analysenzertifikat der Charge und rechnen Sie um.

Die veröffentlichte Literatur folgt beiden Konventionen. Methoden zur Trennung von Hautschichten sind oft in Einheiten geschrieben – 500 bis 1000 U/mL in DMEM wurden verwendet, um nach 24 Stunden epidermale Zellverbände von menschlicher Haut abzuziehen –, während Protokolle für Stammzellen und Epithelien üblicherweise in Massenangaben verfasst sind, etwa 1 mg/mL für das Passagieren humaner pluripotenter Stammzellen, häufig kombiniert mit 1 mg/mL Kollagenase Typ IV.

Auch die Herstellerunterlagen weichen beim pH-Optimum voneinander ab; in verschiedenen technischen Merkblättern finden sich Angaben von 5.9–7.0 bis hin zu 8.5. Übereinstimmend ist quellenübergreifend, dass das Enzym über einen breiten neutralen Bereich aktiv und stabil ist, etwa pH 4 bis 9 – daher der Name „neutrale Protease“. In der Praxis funktioniert ein Verdau in einer üblichen ausgewogenen Salzlösung bei physiologischem pH-Wert, und die Abweichungen bei den angegebenen Optima müssen Sie nicht auflösen, um ein Ergebnis zu erhalten.

Eine Stammlösung ansetzen. Üblich sind 5 mg/mL, gelöst in Wasser in Zellkulturqualität und zur Sterilisation über einen 0.2-Mikrometer-Filter gegeben. Es gibt auch gebrauchsfertige sterile Lösungen, typischerweise mit 10 mg/mL, die das Einwiegen und das Filtrieren ersparen. Dispase ist in Lösung bei 2–8 °C etwa 12 Monate stabil; eingefrorene Stammlösungen sollten aliquotiert und nur einmal aufgetaut werden.

Entscheidend: in einem calciumhaltigen Puffer verdünnen. Dispase benötigt Calcium für die strukturelle Stabilität; die optimale Calciumkonzentration liegt bei etwa 2 mM. Verdünnt man Dispase in calcium- und magnesiumfreiem PBS oder DPBS – dem Puffer, zu dem man bei Trypsin-EDTA greifen würde –, destabilisiert das Enzym zunehmend. Verwenden Sie HBSS oder DPBS mit Calcium und Magnesium oder ein Vollmedium. Das ist die Umkehrung der Regel für Trypsin-EDTA und eine häufige Ursache für unerklärlichen Aktivitätsverlust.

Protokoll 1 – Epidermis von der Dermis trennen. Die veröffentlichten Ansätze decken eine große Spanne von Konzentration und Zeit ab, die gegeneinander abgewogen werden:

1. Spülen Sie die Hautprobe und schneiden Sie sie in wenige Millimeter breite Streifen.
2. Lassen Sie das Gewebe mit der Dermisseite nach unten auf der Dispase-Lösung schwimmen. Zwei gebräuchliche Bedingungen sind 1 mg/mL in PBS bei 37 °C für etwa 30 Minuten oder eine höhere Konzentration (500–1000 U/mL) mit verlängerter Inkubation von bis zu 24 Stunden; eine dritte, ebenfalls weit verbreitete Option ist die Inkubation über Nacht bei 4 °C für 15–18 Stunden, wie sie in manchen Herstelleranleitungen angegeben ist.
3. Überführen Sie das Gewebe in eine Schale mit Puffer und ziehen Sie den epidermalen Zellverband mit einer feinen Pinzette von der Dermis ab. Er sollte sich als geschlossener Verband lösen.
4. Schließen Sie ein zweites Enzym an, wenn einzelne Keratinozyten gewünscht sind – an dieser Stelle wird üblicherweise Trypsin-EDTA verwendet, um den Verband zu dissoziieren.

Protokoll 2 – eine Epithelmonoschicht intakt ablösen. Wenn das Ziel ein geschlossener Zellverband und keine Suspension ist:

1. Medium absaugen und die Monoschicht mit einer calciumhaltigen ausgewogenen Salzlösung spülen. Keine EDTA-haltige Waschlösung verwenden.
2. So viel Dispase-Lösung zugeben, dass die Wachstumsfläche bedeckt ist.
3. Bei 37 °C inkubieren und alle 10–15 Minuten kontrollieren. Der Zellverband beginnt sich an den Rändern abzulösen.
4. Den abgelösten Verband durch behutsames Aufsaugen mit einer weitlumigen Pipette aufnehmen. Nicht kräftig pipettieren; der Sinn von Dispase liegt gerade darin, dass der Verband ganz bleibt.

Protokoll 3 – Dispase als zweites Enzym. Dispase wird sehr häufig zusammen mit Kollagenase zur Dissoziation von Festgewebe eingesetzt: Kollagenase greift das fibrilläre interstitielle Kollagen an, Dispase übernimmt Basalmembran und Fibronektin. Beide werden in der Regel im selben Verdau in einem calciumhaltigen Puffer bei 37 °C unter behutsamer Bewegung kombiniert; die Dauer richtet sich nach Gewebeart und Fragmentgröße.

Der zuverlässige Weg, Dispase zu stoppen, ist die Chelatierung. Die Zugabe von EDTA oder EGTA bis zu einer Endkonzentration von etwa 1 mM entzieht das katalytische Zink und inaktiviert das Enzym. Auch 1,10-Phenanthrolin und Schwermetalle hemmen es. Das ist ein harter chemischer Stopp, und er ist verlässlich.

Serum ist kein zuverlässiger Stopp, und die Quellen widersprechen sich darin. Manche veröffentlichten Protokolle brechen den Dispase-Verdau mit einem gleichen Volumen Medium mit 10 % Serum ab und berichten, dass das funktioniert. Manche Herstellerunterlagen geben dagegen an, dass Dispase durch Serum nicht gehemmt wird – was als Vorteil dargestellt wird, weil das Enzym dann in Vollmedium eingesetzt werden kann. Beide Aussagen können teilweise zutreffen: Serum enthält Breitband-Proteasehemmer, doch Dispase ist keine Serinprotease, und die Serinproteasehemmer, die Trypsin so entschieden stilllegen, greifen hier nicht. Insbesondere Sojabohnen-Trypsininhibitor hat auf Metalloproteasen keine Wirkung.

Die praktische Konsequenz: Verlassen Sie sich nicht allein auf Serum, um Dispase zu stoppen. Wenn die Reaktion zu einem festgelegten Zeitpunkt enden soll, chelatieren Sie. Wenn das Enzym entfernt werden soll, verdünnen und waschen Sie durch Zentrifugation. Serumhaltiges Medium ist als Verdünnungsmittel für diesen Waschschritt in Ordnung, doch die eigentliche Arbeit leistet die Verdünnung und nicht das Serum.

Die Kehrseite überrascht viele in die andere Richtung. Weil Chelatbildner Dispase inaktivieren, können Sie Zellen nicht unmittelbar aus einem EDTA-haltigen Schritt – Trypsin-EDTA, Versene oder ACK-Lysepuffer, der EDTA enthält – in einen Dispase-Verdau übernehmen und erwarten, dass die Dispase arbeitet. Restliches EDTA hemmt sie, mitunter vollständig. Waschen Sie zwischen den beiden Schritten zweimal in einem calciumhaltigen Puffer.

Diese drei sind nicht austauschbar, und die Wahl zwischen ihnen ist vor allem eine Frage danach, was Ihr Gewebe zusammenhält und was den Vorgang überstehen muss.

Trypsin ist eine Serinprotease mit breiter Spezifität für Peptidbindungen nach Lysin und Arginin. Es ist schnell, günstig und wirksam – und es arbeitet unterschiedslos: Es spaltet Zelloberflächenproteine ebenso wie alles andere, sodass Oberflächenepitope beschädigt und Zell-Zell-Verbindungen zerstört werden. Es erzeugt Einzelzellsuspensionen, was oft genau das Gewünschte und manchmal genau das Gegenteil davon ist. Fibrilläres Kollagen verdaut es schlecht, weshalb es bei bindegewebsreichem Festgewebe schwach abschneidet.

Kollagenase aus Clostridium histolyticum spaltet natives Kollagen in der Tripelhelix, was fast keine andere Protease kann. Sie ist das Enzym für Festgewebe mit ausgeprägter interstitieller Kollagenmatrix. Handelsübliche Kollagenase wird als Mischung geliefert, die sich im Verhältnis der Nebenaktivitäten unterscheidet – Clostripain-, Caseinase- und tryptische Aktivität –, und die Typbezeichnungen spiegeln wider, für welche Gewebe die jeweilige Mischung geeignet ist. Typ I ist die Allzweckmischung für Epithel, Leber, Lunge, Fettgewebe und Nebennierengewebe; Typ II hat höhere Clostripain-Aktivität und eignet sich für Herz, Knochen, Muskel und Knorpel; Typ IV hat geringe tryptische Aktivität und wird gewählt, wenn es auf unversehrte Rezeptoren ankommt, klassisch bei Pankreasinseln und Adipozyten. Wie Dispase ist Kollagenase eine calciumabhängige Metalloprotease und wird durch EDTA gehemmt.

Dispase besetzt den Bereich, den keine der beiden abdeckt: die Basalmembran. Sie greift fibrilläres Kollagen Typ I in keinem nennenswerten Maß an und trägt die Zelloberfläche nicht aggressiv ab, zerlegt aber das Fibronektin und das Kollagen Typ IV, die ein Epithel an seinem Untergrund verankern. Deshalb ist sie das Enzym für die Trennung von Dermis und Epidermis und für das Ablösen ganzer Epithelverbände, und deshalb wird sie bei Festgewebe so oft mit Kollagenase kombiniert statt allein eingesetzt.

Am klarsten ist die Entscheidung, wenn es auf die Unversehrtheit des Epithelverbands ankommt. Wollen Sie einen geschlossenen Verband, verwenden Sie Dispase und gehen Sie behutsam damit um. Wollen Sie Einzelzellen aus diesem Verband, verwenden Sie zuerst Dispase und anschließend Trypsin-EDTA. Von Anfang an mit Trypsin zu arbeiten liefert Einzelzellen, zerstört aber die Verbindungsproteine, die Sie vielleicht untersuchen wollten; und Kollagenase allein zerkaut an der Haut die Dermis, ohne die Epidermis sauber abzulösen.

Lagerung. Lyophilisierte Dispase ist bei 2–8 °C etwa 12 Monate stabil. Lösungen werden üblicherweise eingefroren und lichtgeschützt gelagert und sollten so aliquotiert werden, dass ein Arbeitsvolumen einmal aufgetaut und nicht mehrfach eingefroren wird. Wie bei jeder Protease führt wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu autolytischem Aktivitätsverlust, der unsichtbar bleibt, bis ein Verdau unerklärlich nicht mehr funktioniert.

Sterilität und Endotoxin. Dispase-Präparate sind bakterielle Fermentationsprodukte und ein plausibler Eintragsweg für Endotoxin in eine Primärzellpräparation. Für primäre Immunzellen, Stammzellen oder alles, was auf eine regulierte Anwendung zuläuft, verwenden Sie ein Präparat mit angegebener Endotoxinspezifikation und lösen Sie das Pulver in Wasser in Zellkulturqualität statt in deionisiertem Laborwasser.

Häufige Probleme

Der Verdau ist langsam oder funktioniert nicht. Prüfen Sie zuerst, ob Chelatbildner verschleppt wurden – restliches EDTA aus einem vorherigen Schritt ist die häufigste Ursache. Prüfen Sie dann, ob das Verdünnungsmittel Calcium enthielt; in Ca/Mg-freiem PBS verdünnte Dispase verliert an Stabilität. Prüfen Sie schließlich die spezifische Aktivität der Charge gegen die Charge, für die das Protokoll geschrieben wurde.

Der Epithelverband zerfällt, statt sich ganz abzulösen. Meist zu langer Verdau, zu grobe mechanische Handhabung oder beides. Kontrollieren Sie früher und häufiger und nehmen Sie den Verband mit einer weitlumigen Pipette statt mit einer Standardspitze auf.

Die Viabilität nach der Dissoziation ist schlecht. Dispase ist im Vergleich zu Trypsin schonend, bleibt aber eine Protease, und ein Verdau über Nacht bei 37 °C ist eine lange Zeit im Enzym. Wo ein Protokoll es zulässt, ist ein verlängerter Verdau bei 4 °C schonender als der gleichwertige bei 37 °C.

Die Ausbeute schwankt zwischen den Chargen. Das ist das oben beschriebene Einheitenproblem. Dosieren Sie in Einheiten pro Milliliter, halten Sie Charge und spezifische Aktivität in der Methode fest und titrieren Sie beim Chargenwechsel neu.

Der nachgelagerte Assay verhält sich merkwürdig. Dispase lässt Zelloberflächenproteine im Vergleich zu Trypsin weitgehend intakt, aber „weitgehend“ ist nicht „vollständig“, und das Fibronektin, das sie spaltet, gehört zu der Matrix, die die Zellen zum erneuten Anheften brauchen. Gönnen Sie den Zellen eine Erholungsphase in Vollmedium, bevor Sie Assays durchführen, die von der Adhäsion abhängen.