HBSS (Hanks' ausgewogene Salzlösung)

HBSS ist eine ausgewogene Salzlösung, kein Wachstumsmedium. Sie liefert die anorganischen Ionen, die eine Zelle zur Aufrechterhaltung ihres osmotischen Gleichgewichts und ihres Membranpotenzials benötigt, dazu Glucose als unmittelbare Energiequelle — aber keine Aminosäuren, keine Vitamine und kein Protein. Zellen überleben darin über Stunden; sie wachsen darin nicht.

Die Formulierung geht auf John Hanks zurück, der die Salzmischung in den 1940er-Jahren entwickelte; die üblicherweise zitierte Arbeit ist Hanks und Wallace, 1949, über die Konservierung von Geweben durch Kühlung. Die Entwurfsabsicht zeigt sich in der Zusammensetzung: Hanks' Salze waren für die Handhabung und den Transport von Gewebe unter normalen atmosphärischen Bedingungen gedacht, daher ist das Bicarbonat niedrig und das Phosphat übernimmt den größten Teil der Pufferung.

Die alltäglichen Anwendungen sind:

• Waschen von Zellen und Monolayern vor der Trypsinierung, Fixierung oder Lyse, um Serum und Restmedium zu entfernen
• Spülen zwischen Färbe- oder Assayschritten
• Transport und kurzzeitiges Halten von Gewebe und Primärisolaten
• Verdünnen von Enzymen, Reagenzien und Zellsuspensionen
• Assaypuffer für kurze funktionelle Arbeiten, bei denen Glucose, aber kein Vollmedium erwünscht ist

HBSS ist bewusst einfach gehalten, und genau diese Einfachheit macht es so brauchbar: nichts darin stört einen nachgelagerten enzymatischen Schritt oder eine Proteinbestimmung.

Die Standardformulierung der ausgewogenen Salzlösung nach Hanks:

* Entfällt in der Calcium- und Magnesium-freien Variante.

Zwei Merkmale bestimmen das Verhalten von HBSS.

Das Bicarbonat ist sehr niedrig — 350 mg/L gegenüber 2000 mg/L in RPMI 1640 und 3700 mg/L in DMEM. Hanks' Salze wurden für atmosphärisches CO2 formuliert. Der größte Teil der pH-Stabilität in HBSS stammt aus dem Phosphatpaar (KH2PO4 und Na2HPO4), das unabhängig von CO2 puffert.

Es enthält Glucose in einer Konzentration von 5.55 mM, anders als PBS und DPBS. Das ist ein realer funktioneller Unterschied: Zellen, die in HBSS gehalten werden, verfügen über eine Energiequelle, was bei langen Dissoziationen, beim Gewebetransport und bei funktionellen Assays ins Gewicht fällt. Es bedeutet zugleich, dass HBSS bakterielles Wachstum unterstützt, wenn es kontaminiert wird — behandeln Sie es daher mit derselben aseptischen Sorgfalt wie ein Medium.

Die Gesamtosmolalität liegt nahe am physiologischen Wert, bei etwa 280–300 mOsm/kg, und der Arbeits-pH-Wert bei etwa 7.0–7.4.

Das ist die Entscheidung, die am häufigsten falsch getroffen wird, und die Logik dahinter ist klar, sobald man sie einmal ausspricht.

Zweiwertige Kationen sind für die Zelladhäsion erforderlich. Calcium ist unverzichtbar für Cadherin-vermittelte Zell-Zell-Kontakte; Calcium und Magnesium zusammen werden für die Integrin-vermittelte Anheftung an das Substrat benötigt. Entfernt man sie, schwächt sich die Adhäsion ab.

Verwenden Sie Calcium- und Magnesium-freies HBSS, wenn sich Zellen ablösen sollen. Das ist der Waschschritt unmittelbar vor Trypsin oder einem anderen Dissoziationsreagenz. Das Spülen eines Monolayers mit Ca/Mg-freiem HBSS entfernt zum einen das Serum — das Proteaseinhibitoren enthält, die das Trypsin abschwächen würden — und beginnt zum anderen, die Zellkontakte zu lockern, sodass die anschließende Zelldissoziation schneller und schonender verläuft. Ca/Mg-freies HBSS ist außerdem das richtige Verdünnungsmittel für EDTA-basierte Dissoziationsreagenzien, da Calcium im Puffer das EDTA schlicht komplexieren würde.

Verwenden Sie HBSS mit Calcium und Magnesium, wenn Zellen angeheftet und funktionsfähig bleiben sollen. Das Waschen eines Monolayers, den Sie weiterkultivieren wollen, das Halten eines Primärisolats, der Gewebetransport und jeder funktionelle Assay, bei dem Signalübertragung eine Rolle spielt — Calcium ist ein sekundärer Botenstoff, und ein calciumfreier Puffer verfälscht Antworten in Bildgebungs-, Sekretions- und Aktivierungsassays. Zweiwertige Kationen sind zudem für viele Enzyme erforderlich, darunter Kollagenase, weshalb Kollagenase-Verdaue die Ca/Mg-haltige Form verwenden sollten.

Eine brauchbare Faustregel: Folgt als nächster Schritt ein Enzym oder eine funktionelle Messung an lebenden Zellen, nehmen Sie die Ca/Mg-haltige Variante. Folgt als nächster Schritt die Ablösung, nehmen Sie die Ca/Mg-freie.

Diese drei werden in der Praxis nahezu austauschbar eingesetzt, und meistens ist das auch unproblematisch — aber nicht immer. Die Vergleichstabelle auf dieser Seite zeigt die Ebene der Einzelkomponenten; die praktischen Unterschiede sind die folgenden.

Glucose. HBSS enthält sie (5.55 mM), PBS und DPBS nicht. Wenn Zellen länger als ein paar Minuten gehalten, dissoziiert, transportiert oder funktionell gemessen werden, ist die Glucose im HBSS ein echter Vorteil. Für eine 30-sekündige Spülung vor der Lyse macht sie keinen Unterschied.

Pufferung. DPBS ist von den dreien der stärkste einfache Puffer — sein Phosphat liegt bei insgesamt etwa 8 mM, ein Mehrfaches der rund 0.8 mM in HBSS — und hält den pH-Wert auf der offenen Werkbank ohne CO2 gut. HBSS stützt sich auf einen schwächeren Phosphatpuffer plus einen kleinen Bicarbonatbeitrag. Im 5% CO2-Inkubator liegt das Bicarbonat von HBSS weit unter dem, was zum Halten des pH-Werts nötig wäre; HBSS ist daher für längeren Inkubatorbetrieb ungeeignet.

Zweiwertige Kationen. Alle drei werden mit und ohne Calcium und Magnesium geliefert, und für alle drei gilt dieselbe Auswahllogik.

Ionische Feinheiten. HBSS liegt näher am Ionenprofil eines Mediums — es führt Magnesium sowohl als Sulfat als auch als Chlorid und hat eine geringere Phosphatfracht. DPBS ist eine Kochsalzlösung mit einem starken Phosphatpuffer. Dieses starke Phosphat ist in einem bestimmten Fall ein Nachteil: Phosphat fällt Calcium aus, sodass DPBS mit Calcium bei langer Lagerung oder nach dem Autoklavieren unlösliches Calciumphosphat bilden kann; außerdem stört Phosphat manche phosphatempfindlichen Assays und Mineralisierungsstudien.

Schnelle Auswahl: Spülen vor Lyse oder Fixierung — jede der drei Lösungen. Vor der Trypsinierung — Ca/Mg-frei, jede der drei, üblicherweise aber HBSS oder DPBS. Gewebetransport oder lange Dissoziation — HBSS mit Ca/Mg wegen der Glucose. Lange Arbeitsschritte auf der Werkbank ohne CO2 und ohne zu versorgende Zellen — DPBS wegen der stärkeren Pufferung. Mineralisierungs- oder phosphatempfindliche Assays — HBSS statt DPBS.

HBSS wird hauptsächlich durch sein Phosphatpaar gepuffert, mit einem kleinen Beitrag von 4.17 mM Bicarbonat. Phosphat puffert gut um pH 7.2 und ist unabhängig von CO2 — genau das, was eine Handhabungslösung für die Werkbank braucht.

Die Konsequenz ist: HBSS ist keine Inkubatorlösung. In einer 5% CO2-Atmosphäre säuert gelöstes CO2 die Lösung an, und 4 mM Bicarbonat können dem nicht standhalten. Zellen, die im CO2-Inkubator in HBSS stehen gelassen werden, sitzen bei fallendem pH-Wert — einer jener Fehler, die zu einem langsamen, unerklärlichen Verlust der Lebensfähigkeit führen statt zu einem offensichtlichen Fehlschlag.

Umgekehrt verliert HBSS, das bei atmosphärischem CO2 stehen bleibt, sein wenig vorhandenes Bicarbonat langsam als CO2 und driftet ins Alkalische. In der Praxis ist das geringfügig und spielt über die Zeiträume, für die HBSS normalerweise verwendet wird, keine Rolle.

Wenn Sie eine Lösung brauchen, die den pH-Wert während einer langen Prozedur außerhalb des Inkubators zuverlässig hält, ist HBSS mit 10–25 mM HEPES die übliche Antwort. HEPES puffert ohne CO2 gut bei pH 7.2–7.4. Die Abwägungen sind wie immer dieselben: HEPES bildet unter Lichteinwirkung Wasserstoffperoxid und ist für manche Primärzellen bei 25 mM zytotoxisch.

Lagerung. HBSS ist bei 2–8 °C stabil, bei manchen Formulierungen auch bei Raumtemperatur — richten Sie sich nach dem Etikett des Herstellers. Die Haltbarkeit ungeöffnet beträgt typischerweise 12–24 Monate. Da es Glucose enthält, unterstützt es bei Kontamination mikrobielles Wachstum; arbeiten Sie aseptisch und gießen Sie nichts in die Vorratsflasche zurück.

Temperatur. Zum Waschen adhärenter Zellen verwenden Sie HBSS bei Raumtemperatur oder 37 °C. Eiskalter Puffer auf einem warmen Monolayer verursacht einen Kälteschock und kann Ablösung oder Membranschäden auslösen. Kaltes HBSS ist dann angebracht, wenn Sie den Stoffwechsel bewusst verlangsamen wollen — Gewebetransport, manche Primärisolierungen — aber das ist eine Entscheidung, keine Voreinstellung.

Verwenden Sie HBSS nicht als Kulturmedium. Es enthält keine Aminosäuren, Vitamine, Lipide oder Proteine. Zellen tolerieren einige Stunden; über Nacht in HBSS ist ein Lebensfähigkeitsexperiment, keine Kultur.

Häufige Fehler:

• Ca/Mg-haltiges HBSS zum Spülen vor der Trypsinierung verwenden. Die zweiwertigen Kationen erhalten die Adhäsion, die Zelldissoziation dauert länger und braucht mehr Enzym, was die Schädigung erhöht.
• Ca/Mg-freies HBSS als Kollagenase-Verdünnungsmittel verwenden. Kollagenase benötigt Calcium; der Verdau bleibt hinter den Erwartungen zurück.
• EDTA-Dissoziationsreagenzien in Ca/Mg-haltigem Puffer verdünnen. Das Calcium verbraucht den Komplexbildner.
• Zellen in HBSS im CO2-Inkubator stehen lassen. Sein Bicarbonat kann bei 5% CO2 nicht puffern, und der pH-Wert fällt.
• Annehmen, HBSS und PBS seien für funktionelle Assays gleichwertig. Die Glucose und das andere Ionengleichgewicht sind immer dann von Bedeutung, wenn Zellen gemessen und nicht bloß gespült werden.
• DPBS für Mineralisierungsarbeiten verwenden. Sein hoher Phosphatgehalt verfälscht die Calciumphosphat-Ablagerung; HBSS ist hier die bessere Wahl.