Rekombinantes Humaninsulin in der Zellkultur

Humaninsulin ist ein kleines Protein aus 51 Aminosäuren, das als zwei Ketten vorliegt – einer A-Kette mit 21 Resten und einer B-Kette mit 30 –, die über zwei Disulfidbrücken zwischen den Ketten verbunden sind; eine dritte Disulfidbrücke liegt innerhalb der A-Kette. Sein Molekulargewicht beträgt etwa 5.8 kDa (5808 Da), sein isoelektrischer Punkt liegt bei etwa pH 5.3–5.4 – eine Eigenschaft, die bestimmt, wie mit ihm umzugehen ist.

In der Zellkultur gehört Insulin zu den wenigen Zusätzen, die aus einem Basalmedium etwas machen, worin Zellen ohne Serum tatsächlich wachsen. Seine Funktionen sind:

• Förderung der Nährstoffaufnahme. Insulin fördert den Glukosetransport und die Aminosäureaufnahme, was bei einer rasch teilenden Kultur unmittelbar die Wachstumsrate sowie die Biomasse und Produktmenge bestimmt, die ein Bioreaktor tragen kann.
• Anabole Signalgebung. Es stimuliert die Protein- und Nukleinsäuresynthese sowie die Lipogenese und unterdrückt katabole Stoffwechselwege.
• Überlebenssignal. Die Aktivierung des Insulinrezeptors schaltet den PI3K-Akt-Signalweg an, der antiapoptotisch wirkt. In serumfreiem Medium, in dem die sonst von Serumwachstumsfaktoren gelieferten Überlebenssignale fehlen, macht dies einen wesentlichen Teil der Insulinwirkung aus.
• Intrazellulärer Transport und allgemeine Stoffwechselunterstützung, weshalb Insulin unabhängig vom Zelltyp in nahezu jeder serumfreien Formulierung enthalten ist.

Der Punkt, den die meisten übersehen: In der Kultur wirkt Insulin weitgehend als Agonist des IGF-1-Rezeptors. Physiologisch zirkulierendes Insulin liegt im nanomolaren Bereich. Die in der Kultur eingesetzte Konzentration – 5–10 µg/mL, also rund 1–2 µM – ist etwa tausendfach höher. Insulin bindet seinen eigenen Rezeptor mit hoher Affinität und den eng verwandten IGF-1-Rezeptor mit deutlich geringerer Affinität; im mikromolaren Bereich wird diese niederaffine Wechselwirkung jedoch relevant. Die mitogene Wirkung von Insulin in der Kultur wird daher wesentlich über die Signalgebung des IGF-1-Rezeptors vermittelt und nicht über die klassische metabolische Insulinsignalgebung.

Das ist keine Spitzfindigkeit. Es erklärt, warum die Kulturkonzentrationen so weit über dem physiologischen Niveau liegen, warum IGF-1-Analoga Insulin ersetzen können und warum eine mit Insulin supplementierte Kultur ein schlechtes Modell für die Untersuchung der physiologischen Insulinsignalgebung ist. Wenn Sie die Insulinwirkung selbst erforschen, liegt die übliche Supplementkonzentration weit außerhalb des physiologischen Bereichs und sättigt beide Rezeptoren.

Rekombinant, nicht tierischen Ursprungs. Insulin für die Zellkultur wurde früher aus Rinder- oder Schweinepankreas extrahiert. Rekombinantes Humaninsulin, exprimiert in E. coli oder in Hefen wie Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris, hat es aus denselben Gründen verdrängt, die für die gesamte Branche gelten: Es ist frei von tierischen Bestandteilen, wodurch ein Eintragsweg für Fremdagenzien und der damit verbundene Dokumentationsaufwand entfallen; es trägt die humane Sequenz, sodass die kleinen Speziesunterschiede von Rinder- und Schweineinsulin vermieden werden; und es ist von Charge zu Charge weitaus konsistenter als ein Gewebeextrakt.

Für jeden Prozess, der frei von tierischen Bestandteilen oder xenofrei sein soll, ist rekombinantes Insulin nicht optional. Beim Zusammenstellen einer definierten Formulierung aus Einzelkomponenten lohnt es sich außerdem zu prüfen, ob das Insulin in einem Supplement tatsächlich rekombinant ist – ein als serumfrei bezeichnetes Medium ist nicht zwangsläufig frei von tierischen Bestandteilen.

Die Zinkform. Insulin wird üblicherweise als zinkstabilisiertes kristallines Pulver geliefert. Zinkionen koordinieren Insulinmonomere zu Hexameren – zwei Zinkionen pro Hexamer –, und die hexamere kristalline Form ist deutlich stabiler als monomeres Insulin, sowohl bei der Lagerung als auch gegenüber Aggregation. Deshalb wird Zellkulturinsulin im Handel als Zinkinsulin oder mit einem angegebenen Zinkgehalt beschrieben.

Praktische Folgen:

• Der Zinkgehalt ist Teil der Spezifikation und sollte beachtet werden, denn Zink ist selbst ein Spurenelement mit biologischer Wirkung. In den zusammen mit Insulin eingetragenen Mengen ist er gegenüber anderen Medienbestandteilen in der Regel vernachlässigbar, bei zinkempfindlichen Arbeiten muss er jedoch berücksichtigt werden.
• Das Hexamer dissoziiert beim Verdünnen. In den im Medium verwendeten Konzentrationen liegt Insulin als Monomer und Dimer vor; die Zinkform beeinflusst daher die Lagerstabilität und nicht die biologische Aktivität.
• Für Anwendungen, bei denen das Zink eine Rolle spielt, gibt es zinkfreie Präparate und Präparate mit festgelegtem Zinkgehalt.

Darreichungsformen. Trockenpulver ist die häufigste Form für den Einsatz in größerem Maßstab und hat die längste Haltbarkeit. Gebrauchsfertige sterile Lösungen ersparen den unten beschriebenen Löseschritt, der die wichtigste praktische Fehlerquelle im Umgang mit Insulin ist, und sind bei kleineren Ansätzen den Aufpreis wert.

Der Standard liegt bei 5–10 µg/mL, und 10 µg/mL ist die Konzentration, die ein 1X-ITS-Supplement liefert. Das passt für die große Mehrheit der Zelltypen und ist ein solider Ausgangswert für eine neue Formulierung.

Der praktische Bereich ist breiter und reicht je nach Zelltyp und Aufgabe der Kultur etwa von 0.1 bis 20 µg/mL:

• Viele CHO- und andere Produktionsprozesse laufen bei 5–20 mg/L (entsprechend 5–20 µg/mL), bei Fed-Batch-Kulturen hoher Dichte teils am oberen Ende.
• Empfindliche Primärzellen und manche Stammzellsysteme kommen mit deutlich weniger aus, im Bereich von 0.1–5 µg/mL.
• Manche neuronalen und spezialisierten Kulturen verzichten bewusst auf Insulin. Insulinfreie Formulierungen gibt es genau deshalb, weil Insulin eine Signalgebung über den IGF-1-Rezeptor auslöst, die Differenzierung, Überlebensassays oder Stoffwechselexperimente stören kann. Wenn Sie ein solches Experiment durchführen, prüfen Sie, ob Ihr Supplement Insulin enthält – das wird leicht übersehen, wenn ein Supplement aus Gewohnheit zugegeben wird.

Optimieren statt übernehmen. Titrieren Sie den Bereich an Ihren eigenen Zellen aus und erfassen Sie Wachstumsrate, maximale lebende Zelldichte, Viabilität und Produkttiter oder funktionellen Endpunkt. Da Insulin im großen Maßstab zu den teureren Bestandteilen eines definierten Mediums gehört und mehr nicht immer besser ist, lohnt es sich, das Optimum zu bestimmen.

Die Stabilität im Medium ist eine reale Einschränkung. Insulin baut sich im vollständigen Medium bei 37 °C innerhalb von Stunden bis etwa einem Tag ab, schneller in Gegenwart von Proteasen und bei erhöhter Temperatur. In einer kurzen Batch-Kultur ist das unerheblich. In einem Fed-Batch- oder Perfusionsprozess über eine Woche oder länger ist das zu Beginn zugegebene Insulin am Ende längst verschwunden, und Prozesse, die darauf angewiesen sind, brauchen eine Nachdosierung über den Feed. Dieser Abbau ist einer der Hauptgründe, weshalb stabilere Alternativen entwickelt wurden.

Alternativen zu Insulin. LongR3 IGF-1 ist ein technisch verändertes Analogon des insulinähnlichen Wachstumsfaktors 1 mit verlängertem N-Terminus und einer Substitution, die die Bindung durch IGF-Bindungsproteine stark verringert. Es ist deutlich potenter und stabiler als Insulin, wird daher in weitaus geringeren Konzentrationen eingesetzt – typischerweise im Bereich von einigen zehn Nanogramm pro Milliliter statt Mikrogramm – und ist in Bioprozessmedien als direkter Ersatz weit verbreitet. Da Insulin in der Kultur ohnehin weitgehend über den IGF-1-Rezeptor wirkt, ist der Einsatz eines optimierten IGF-1-Analogons eine folgerichtige Substitution. Es ist pro Gramm teurer, wird aber nur in einem Bruchteil der Masse benötigt. Natives IGF-1 wird ebenfalls verwendet, ist jedoch weniger stabil und wird von Bindungsproteinen abgefangen.

Hier geht bei Insulin am häufigsten etwas schief, und der Grund ist schlichte Chemie.

Insulin ist nahe dem neutralen pH-Wert schlecht löslich. Sein isoelektrischer Punkt liegt bei etwa 5.3–5.4, und bei pH-Werten nahe der Neutralität trägt es kaum Nettoladung und ist entsprechend schwer löslich. Insulinpulver direkt in ein Kulturmedium mit pH 7.2–7.4 zu geben, funktioniert nicht – es verteilt sich als ungelöste Suspension, die teilweise gelöst aussieht, und wird dann größtenteils vom Sterilfilter zurückgehalten. Das Medium enthält anschließend weit weniger Insulin als vorgesehen, und die Kultur bleibt aus einem Grund hinter den Erwartungen zurück, den man nicht sieht.

Zuerst in verdünnter Säure lösen:

1. Lösen Sie das Pulver in verdünnter Salzsäure, typischerweise 0.01 M (0.01 N), oder in verdünnter Essigsäure bei einer Stammkonzentration von etwa 4–10 mg/mL. Verwenden Sie das kleinstmögliche Säurevolumen.
2. Mischen Sie behutsam, bis alles gelöst ist. Insulin ist ein Protein und denaturiert an Grenzflächen – nicht kräftig vortexen und nicht bis zur Schaumbildung schütteln. Die Lösung muss vollständig klar werden; ist sie es nicht, ist das Insulin nicht gelöst.
3. Zügig neutralisieren oder verdünnen. Längere Lagerung bei niedrigem pH-Wert begünstigt Desamidierung und weitere chemische Zersetzung.
4. Sterilfiltrieren über 0.22 µm. Verwenden Sie eine Membran mit geringer Proteinbindung – Insulin ist klein und adsorbiert merklich an manche Filtermaterialien, und bei diesen niedrigen Konzentrationen ist der Adsorptionsverlust eine echte Fehlerquelle.
5. Auf die endgültige Arbeitskonzentration in das Medium verdünnen. Das geringe mitgeführte Volumen verdünnter Säure wirkt sich auf den pH-Wert eines gut gepufferten Mediums vernachlässigbar aus; prüfen Sie den pH-Wert des fertigen Mediums jedoch, wenn Sie ein großes Volumen der Stammlösung zugeben.

Lagerung. Trockenpulver trocken bei 2–8 °C oder -20 °C lagern, wie vom Hersteller angegeben, und vor Feuchtigkeit schützen. Saure Stammlösungen eingefroren in Einwegaliquots lagern und wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden. Insulin-Stammlösungen nicht bei Raumtemperatur aufbewahren.

Am einfachsten umgeht man all das, indem man eine gebrauchsfertige sterile Insulinlösung kauft oder ein ITS-Supplement verwendet, das korrekt formuliertes Insulin zusammen mit den üblichen Begleitkomponenten liefert. Für die meisten Arbeiten im Labormaßstab ist das die bessere Wahl; das Lösen von Pulver lohnt sich erst im Produktionsmaßstab, wo der Kostenunterschied ins Gewicht fällt.

Insulin wird selten allein eingesetzt. Die Standardkombination ist ITS – Insulin, Transferrin und Selen – geliefert als 100X-Konzentrat. Die Zusammensetzung ist über die Anbieter hinweg einheitlich:

Die drei Komponenten lösen unterschiedliche Probleme, weshalb sie gemeinsam auftreten:

• Insulin liefert das Wachstums- und Überlebenssignal und treibt die Nährstoffaufnahme an.
• Transferrin ist der Eisenträger. Eisen ist für die Zellproliferation unentbehrlich – die Ribonukleotidreduktase benötigt es –, doch freies Eisen katalysiert die Fenton-Reaktion und erzeugt Hydroxylradikale. Transferrin liefert Eisen in gebundener, kontrollierter Form und verringert zugleich die Belastung durch Sauerstoffradikale und Peroxid. Der Zufuhrweg ist ebenso wichtig wie die Menge.
• Selen, als Natriumselenit, ist Cofaktor der Glutathionperoxidase und weiterer Selenoproteine und gehört zur antioxidativen Abwehr der Zelle. Beachten Sie die Einheit: Die Arbeitskonzentration liegt im Nanogramm-Bereich pro Milliliter, drei Größenordnungen unter den beiden anderen. Selen ist in höheren Konzentrationen toxisch, und diese Komponente darf nicht über den Daumen dosiert werden.

Gängige Varianten:

• ITS-G – die Basiskombination, typischerweise mit rekombinantem Humaninsulin und humanem Transferrin, erhältlich in einer Form frei von tierischen Bestandteilen.
• ITS-A – ITS mit zusätzlichem Natriumpyruvat, einem weiteren Energiesubstrat und Fänger für Wasserstoffperoxid.
• ITS-X – ITS mit zusätzlichem Ethanolamin, einer Vorstufe für die Phosphatidylethanolamin-Synthese, nützlich für Zellen mit hohem Membranumsatz und häufig vorteilhaft in proteinarmen Medien und Hybridom-Medien.

Die Wahl zwischen ihnen ist weitgehend empirisch. Beginnen Sie mit ITS-G, sofern Sie keinen Grund zu der Annahme haben, dass Ihre Zellen durch die Verfügbarkeit von Phospholipid-Vorstufen begrenzt sind – dann lohnt ein Test von ITS-X – oder durch das Energiesubstrat, wofür ITS-A infrage kommt.

Prüfen Sie die Herkunft der Bestandteile. ITS-Supplemente gibt es sowohl frei von tierischen Bestandteilen als auch in herkömmlicher Form. Eine Formulierung mit Rindertransferrin oder aus Pankreas gewonnenem Insulin ist nicht frei von tierischen Bestandteilen, unabhängig davon, was das übrige Medium enthält. Für xenofreie und klinisch ausgerichtete Arbeiten ist jede Komponente zu prüfen, nicht nur der Produktname.

Insulinfreie Supplemente gibt es aus guten Gründen. Formulierungen, die ausdrücklich ohne Insulin geliefert werden – darunter insulinfreie Versionen gängiger neuronaler Supplemente –, sind für Experimente gedacht, in denen die Signalgebung über den Insulin- und den IGF-1-Rezeptor das Messergebnis verfälschen würde. Wenn Ihr Experiment die Signalgebung von Wachstumsfaktoren, den Stoffwechsel oder die Differenzierung betrifft, ist ein insulinfreies Supplement mit definierter Rückdosierung oft das sauberere Versuchsdesign.

Adsorptionsverluste sind bei diesen Konzentrationen relevant. Insulin ist ein kleines Protein, das im Bereich von Mikrogramm pro Milliliter eingesetzt wird, und es adsorbiert an Glas- und Kunststoffoberflächen. In kleinen Volumina, in Schläuchen und in proteinarmen Medien ist der Verlust nicht vernachlässigbar. Albumin im Medium verringert ihn deutlich, weil es um die Oberflächenplätze konkurriert – einer von mehreren Gründen, weshalb Albumin und Insulin häufig zusammen verwendet werden. Verwenden Sie beim Umgang mit Stammlösungen Gefäße mit geringer Bindung und setzen Sie keine stark verdünnten Zwischenlösungen an, die vor Gebrauch stehen bleiben.

Nicht autoklavieren. Ausschließlich durch Filtration über 0.22 µm sterilisieren. Hitze zerstört Insulin.

Achten Sie auf das stille Versagen. Der typische Insulinfehler ist eine Formulierung, die ohne erkennbaren Grund einfach schlechter läuft, weil ungelöstes Insulin am Filter zurückgehalten wurde und das Medium nie enthielt, was das Rezept angab. Wenn ein definiertes Medium nicht funktioniert und das Insulin aus Pulver angesetzt wurde, prüfen Sie den Löseschritt, bevor Sie irgendetwas anderes untersuchen.

Halten Sie Konzentration und Bezugsquelle im Methodenteil fest. Die Insulinkonzentration schwankt zwischen veröffentlichten Formulierungen um eine Größenordnung, und der Unterschied ist biologisch bedeutsam. „Serumfreies Medium mit ITS“ lässt Angaben aus, die Lesende zur Reproduktion der Arbeit benötigen.

Berücksichtigen Sie Insulin bei der Auswertung der Ergebnisse. Da übliche Insulinkonzentrationen in der Kultur sowohl den Insulin- als auch den IGF-1-Rezeptor sättigen, läuft jedes Experiment zur Signalgebung von Wachstumsfaktoren, zur PI3K-Akt-Aktivität, zur Stoffwechselregulation oder zur Differenzierung vor einem starken, konstanten Agonisten-Hintergrund ab. Das ist kein Grund, auf Insulin zu verzichten, wohl aber ein Grund, es anzugeben, insulinfreie Kontrollen zu erwägen und einen Effekt nur vorsichtig einer Behandlung zuzuschreiben, wenn die Kultur bereits ein sättigendes Wachstumssignal erhält.