PBS und DPBS: Was sich unterscheidet und welche Lösung Sie brauchen

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung ist eine isotonische Salzlösung, die von einem Paar aus primärem und sekundärem Phosphat nahe dem physiologischen pH-Wert gepuffert wird. Sie enthält keine Glucose, keine Aminosäuren, kein Protein und kein Bicarbonat. Sie ist eine Handhabungslösung — zum Spülen von Monolayern, zum Verdünnen von Zellen, zum Überführen von Zellen zwischen Arbeitsschritten und zum Auswaschen von Serum — und kein Medium, in dem sich Zellen halten lassen.

Das Phosphatpaar macht sie außerhalb des Inkubators brauchbar. Die zweite Dissoziationsstufe der Phosphorsäure hat einen pKa-Wert von etwa 7.2, also fast genau den pH-Wert, bei dem Zellen kultiviert werden; ein Phosphatpuffer hält den pH-Wert deshalb auch an Raumluft gut. Bicarbonatgepufferte Medien beruhen auf dem Kohlensäuresystem, dessen maßgeblicher pKa-Wert bei etwa 6.1 liegt, und brauchen daher eine CO2-Atmosphäre, um pH 7.4 zu halten. Aus diesem Grund erfolgt ein Waschschritt auf der Werkbank in PBS und nicht in Medium.

DPBS ist Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung, nach der Formulierung, die Renato Dulbecco und Marguerite Vogt 1954 bei der Entwicklung von Plaque-Assays für Tierviren beschrieben haben. „DPBS“ benennt also eine bestimmte historische Rezeptur. „PBS“ benennt eine Klasse von Lösungen, und verschiedene Anbieter verkaufen unter diesem Namen deutlich unterschiedliche Produkte.

Der Vergleich der beiden Gibco-Produkte, die genau diese Namen tragen, macht den Unterschied greifbar.

Gibco PBS pH 7.4 enthält Natriumchlorid mit 9.0 g/L (155 mM), Kaliumdihydrogenphosphat mit 144 mg/L (1.06 mM) und Dinatriumhydrogenphosphat-Heptahydrat mit 795 mg/L (2.97 mM). Das Gesamtphosphat liegt bei etwa 4.0 mM, und Kaliumchlorid ist überhaupt nicht enthalten.

Gibco DPBS ohne Calcium und Magnesium enthält Natriumchlorid mit 8.0 g/L (137.9 mM), Kaliumchlorid mit 200 mg/L (2.67 mM), Kaliumdihydrogenphosphat mit 200 mg/L (1.47 mM) und Dinatriumhydrogenphosphat-Heptahydrat mit 2160 mg/L (8.06 mM). Das Gesamtphosphat liegt bei etwa 9.5 mM.

DPBS enthält also weniger Natriumchlorid, zusätzlich Kaliumchlorid und rund das 2.4-Fache an Phosphat. Die praktische Folge ist die Pufferkapazität: Mit etwa 9.5 mM Phosphat widersteht DPBS einer pH-Verschiebung erheblich besser als ein PBS mit 4 mM, wenn Sie Zellen, saure Reagenzien oder einen Schwall Medium hinzugeben. Wenn Sie eine Zellsuspension zwanzig Minuten auf der Werkbank stehen lassen, ist dieser Unterschied spürbar.

Eine Warnung zum Wort PBS. Die Rezeptur, die die meisten molekularbiologischen Labore aus Pulver oder nach einem Protokoll im Sambrook-Stil ansetzen — 8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 —, liegt nahe an Dulbeccos Formulierung, mit etwa 12 mM Gesamtphosphat. Dieses selbst angesetzte „PBS“ steht DPBS näher als einer gekauften Flasche mit der Aufschrift PBS pH 7.4. Lesen Sie stets die Formulierung auf dem Etikett, statt die Zusammensetzung aus den drei oder vier Buchstaben auf der Vorderseite abzuleiten.

Sowohl PBS als auch DPBS werden in einer Variante mit Calcium und Magnesium und in einer Variante ohne verkauft. Das ist die Entscheidung, die den Ausgang eines Versuchs verändert, und sie ist davon unabhängig, ob auf der Flasche PBS oder DPBS steht.

Gibco DPBS mit Calcium und Magnesium ergänzt dieselbe Grundlösung um Calciumchlorid mit 100 mg/L (0.90 mM Ca2+) und Magnesiumchlorid-Hexahydrat mit 100 mg/L (0.49 mM Mg2+). Sonst ändert sich nichts.

Beide Kationen sind für die Zelladhäsion strukturell notwendig. Cadherine — die Proteine, die Zellen an Adhärenzverbindungen aneinander halten — sind per Definition calciumabhängig; ihre extrazellulären Domänen brauchen gebundenes Ca2+, um die starre Konformation einzunehmen, die eine Bindung erlaubt, und sie verlieren ihre Adhäsionsfunktion und werden proteaseempfindlich, sobald Calcium entzogen wird. Integrine, die Zellen an die extrazelluläre Matrix binden, koordinieren in ihrer Ligandenbindungstasche an der metallionenabhängigen Adhäsionsstelle ein zweiwertiges Kation und binden ohne dieses keinen Liganden.

Entziehen Sie Ca2+ und Mg2+, destabilisieren Sie beide Systeme auf einmal. Geben Sie sie zu, erhalten Sie beide. Mehr steckt in dieser Entscheidung nicht.

Der häufigste Fehler mit diesen Lösungen besteht darin, einen Monolayer unmittelbar vor der Trypsinzugabe mit einer calcium- und magnesiumhaltigen Lösung zu waschen und sich anschließend zu wundern, warum die Zellen zwölf Minuten zum Ablösen brauchen und dann als zusammenhängende Verbände abgehen.

Der Waschschritt vor der Trypsinierung hat zwei Aufgaben. Die offensichtliche ist das Entfernen des Serums, denn Serum enthält Alpha-1-Antitrypsin und weitere Proteasehemmer, die das gleich zugegebene Trypsin neutralisieren. Die weniger offensichtliche ist das Herauslösen der zweiwertigen Kationen aus den Zellverbindungen, damit die Cadherinkontakte bereits gelockert sind, wenn das Enzym eintrifft. Ein Ca/Mg-haltiger Waschschritt erfüllt die erste Aufgabe und macht die zweite aktiv zunichte.

Das Ergebnis ist ein längerer Verdau. Ein längerer Verdau bedeutet mehr Proteolyse des Oberflächenproteoms, geringere Lebensfähigkeit und mehr von jener Verklumpung, die eine Zählung in der Zählkammer oder eine Einzelzellsuspension für Durchflusszytometrie oder Sequenzierung verdirbt. Übliche Trypsin-EDTA-Lösungen sind ihrerseits in einer calcium- und magnesiumfreien ausgewogenen Salzlösung formuliert und enthalten EDTA genau deshalb, um restliche Kationen zu binden — ein Ca/Mg-haltiger Waschschritt bedeutet also, dass sich das EDTA Ihres Ablösereagenzes daran verbraucht, Ihren eigenen Waschschritt rückgängig zu machen.

Der umgekehrte Fehler kommt ebenso vor. Wenn Sie einen adhärenten Monolayer wiederholt in einer Ca/Mg-freien Lösung waschen, obwohl die Zellen haften bleiben sollen — während eines Immunfluoreszenzprotokolls, vor der Fixierung oder zwischen Stimulationsschritten —, verlieren Sie Zellen von der Platte und sehen eine lückenhafte, retrahierte Morphologie. Für diese Schritte ist die calcium- und magnesiumhaltige Variante die richtige Wahl.

Hanks' ausgewogene Salzlösung ist die dritte Flasche in dieser Diskussion, und sie unterscheidet sich von beiden Phosphatkochsalzlösungen in zwei Punkten, die darüber entscheiden, wann Sie zu ihr greifen.

Erstens enthält HBSS D-Glucose mit 1.0 g/L (5.6 mM). PBS und DPBS enthalten überhaupt keine Energiequelle. Jedes Verfahren, bei dem Zellen länger als ein paar Minuten bei 37 C in der Lösung stehen — Gewebedissoziation, Organperfusion, eine lange Sortierung, Bildgebung auf einem beheizten Tisch —, sollte HBSS oder EBSS statt PBS verwenden.

Zweitens ist HBSS nicht in erster Linie ein Phosphatpuffer. Sie trägt nur etwa 0.78 mM Gesamtphosphat (Kaliumdihydrogenphosphat 60 mg/L plus Dinatriumhydrogenphosphat 48 mg/L) und nutzt stattdessen Natriumbicarbonat mit 350 mg/L (4.17 mM). Dieser niedrige Bicarbonatgehalt ist Absicht: Hanks' Salze sind so formuliert, dass sie den pH-Wert an Umgebungsluft in einem geschlossenen Gefäß ohne CO2-Inkubator halten.

Earles ausgewogene Salzlösung ist der umgekehrte Entwurf. Sie trägt Natriumbicarbonat mit 2.2 g/L (26.2 mM) und ist für den Einsatz in einer 5% CO2-Atmosphäre gedacht. Stellen Sie EBSS auf die offene Werkbank, driftet sie alkalisch, weil CO2 entweicht; stellen Sie ein Hanks-basiertes Medium in einen Inkubator mit 10% CO2, wird es sauer. Die allgemeine Regel der Anbieter lautet, das Bicarbonat auf die Atmosphäre abzustimmen: unter etwa 1.5 g/L für Umgebungsluft oder 4% CO2, 1.5-2.2 g/L für 5%, 2.2-3.4 g/L für 7% und über 3.5 g/L für 10%.

HBSS und EBSS enthalten in ihrer Standardform ebenfalls beide Calcium und Magnesium, und beide werden für Ablösearbeiten auch Ca/Mg-frei verkauft, genau wie die Phosphatkochsalzlösungen.

Verwenden Sie ein calcium- und magnesiumfreies PBS oder DPBS für: das Abspülen von Serum von einem Monolayer vor der Ablösung mit Trypsin, TrypLE oder EDTA; das Verdünnen oder Resuspendieren von Zellen für die Zählung; das Waschen von Pellets vor der Lyse; die Herstellung von Einzelzellsuspensionen für Durchflusszytometrie oder Einzelzellsequenzierung; und als Verdünnungsmittel für EDTA-basierte Ablöselösungen.

Verwenden Sie ein PBS oder DPBS mit Calcium und Magnesium für: das Waschen adhärenter Zellen, die adhärent bleiben sollen; Waschschritte in Immunzytochemie und Immunfluoreszenz; Assays, bei denen zweiwertige Kationen funktionell erforderlich sind, etwa integrin- oder lektinvermittelte Bindung; und das Resuspendieren von Zellen, die ihre Adhäsionsfähigkeit behalten müssen.

Verwenden Sie HBSS oder EBSS statt beider, wenn: Zellen länger als etwa fünfzehn Minuten bei 37 C in der Lösung stehen oder das Verfahren eine Energiequelle braucht — Dissoziation von Primärgewebe, Perfusion, Transport von Biopsien, längere Handhabung lebender Zellen. Wählen Sie Hanks' Salze für Arbeiten an Luft und Earles Salze für Arbeiten im CO2-Inkubator.

Verwenden Sie keine dieser Lösungen als Medium. Keine davon enthält Aminosäuren, Vitamine oder Protein. Zellen, die in einer ausgewogenen Salzlösung gehalten werden, zehren aus, und die Lebensfähigkeit fällt schon innerhalb von ein bis zwei Stunden messbar ab, selbst in den glucosehaltigen Varianten.

Eine Flasche mit der Aufschrift DPBS liegt nicht zwangsläufig bei pH 7.4. Gibco spezifiziert DPBS mit pH 7.0-7.3 ohne Calcium und Magnesium und mit pH 7.0-7.2 mit beiden, während das als PBS pH 7.4 verkaufte Produkt auf 7.4 titriert ist. Hängt Ihr Protokoll von einem Ausgangs-pH-Wert ab — ein pH-empfindlicher Farbstoff, ein Fluorophor mit pH-abhängiger Quantenausbeute, ein Bindungsassay —, prüfen Sie das Analysenzertifikat, statt es vorauszusetzen.

Konzentrate und Pulver sind meist Ca/Mg-frei. Calcium- und Magnesiumphosphate sind nur begrenzt löslich, deshalb werden 10X-Konzentrate, Pulverformate und alles, was autoklaviert werden soll, in der Regel ohne zweiwertige Kationen geliefert; diese werden danach aus einer separaten sterilen Stammlösung zugegeben. Wenn Sie ein 10X-DPBS verdünnen und darin Calcium erwarten, prüfen Sie das Etikett.

Das Autoklavieren einer Ca/Mg-haltigen Phosphatkochsalzlösung kann zu Ausfällungen führen. Die Sterilfiltration über 0.2 um ist der sicherere Weg für jede calciumhaltige Phosphatkochsalzlösung.

Phenolrot ist optional und für die Pufferung ohne Bedeutung. Die meisten PBS- und DPBS-Produkte werden ohne geliefert. Varianten mit Phenolrot gibt es vor allem, damit Sie eine grobe pH-Drift oder eine Kontamination erkennen können; sie stören Absorptions- und Fluoreszenzmessungen genauso wie Phenolrot im Medium.

PBS-EDTA ist ein anderes Produkt. Ein PBS oder DPBS mit 0.5 mM EDTA ist ein Ablösereagenz und kein Waschpuffer. Ersetzen Sie damit kein reines PBS in einem Spülschritt, und lassen Sie Zellen nicht darin stehen, während Sie sich um etwas anderes kümmern.