MEM Alpha (α-MEM) und Minimum Essential Medium

Harry Eagle veröffentlichte das Minimum Essential Medium 1959 in Science, nachdem er über mehrere Jahre systematisch bestimmt hatte, was eine Säugerzelle in Kultur tatsächlich benötigt. MEM ist bewusst minimal gehalten: dreizehn essenzielle Aminosäuren, acht Vitamine, Glucose und die sechs anorganischen Salze der Earle-Salzlösung (Calciumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Natriumphosphat und Natriumhydrogencarbonat). Sonst nichts. Genau darin lag der Sinn — MEM wurde damit zu einer definierten Ausgangsbasis, an der sich der Bedarf jedes Zelltyps prüfen ließ.

α-MEM ist die „Alpha-Modifikation", 1971 von Clifford Stanners, Gerald Eliceiri und Howard Green veröffentlicht, die damals an Ribosomen in Maus-Hamster-Hybridzellen arbeiteten. Sie brauchten ein reicheres Medium, das Hybridzellen und anspruchsvolle Zellen trägt, ohne zu den sehr hohen Aminosäurekonzentrationen von DMEM überzugehen. Ihre Modifikation ließ Salzbasis und Glucose von MEM unverändert und ergänzte Nährstoffe:

• Alle nichtessenziellen Aminosäuren — Alanin, Asparagin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin, Prolin und Serin sowie Cystein
• Natriumpyruvat mit 110 mg/L (1 mM)
• Ascorbinsäure (Vitamin C) mit 50 mg/L, Biotin mit 0.1 mg/L, Vitamin B12 mit etwa 1.3 mg/L
• Liponsäure mit 0.2 mg/L
• Wahlweise Ribonukleoside und Desoxyribonukleoside

Das Ergebnis ist ein Medium, das nährstoffreicher ist als MEM, aber dessen ionische Zusammensetzung und CO2-Bedarf teilt — und genau deshalb verhält sich α-MEM anders als DMEM, obwohl beide „angereichertes MEM" sind.

Dies ist die Standardformulierung von MEM mit Earle-Salzen — also das Medium, das ohne weitere Angabe als „MEM", „EMEM" oder „MEM Eagle" verkauft wird.

Anorganische Salze und weitere Bestandteile

Aminosäuren (mg/L) — ausschließlich die dreizehn essenziellen

L-Arginin·HCl 126; L-Cystin·2HCl 31; L-Histidin·HCl·H2O 42; L-Isoleucin 52; L-Leucin 52; L-Lysin·HCl 73; L-Methionin 15; L-Phenylalanin 32; L-Threonin 48; L-Tryptophan 10; L-Tyrosin (als Dinatriumsalz-Dihydrat) 52; L-Valin 46; dazu L-Glutamin 292.

Vitamine (mg/L) — acht

Cholinchlorid 1; D-Calciumpantothenat 1; Folsäure 1; Niacinamid 1; Pyridoxal·HCl 1; Thiamin·HCl 1; i-Inositol 2; Riboflavin 0.1.

Das ist das gesamte Medium. MEM enthält keine nichtessenziellen Aminosäuren, keine Nukleoside, kein Pyruvat, kein Ascorbat, kein Biotin, kein Vitamin B12, keine Liponsäure und keine Spurenelemente. Diese Beschränkung ist gewollt — Eagle wollte feststellen, was eine Säugerzelle mindestens braucht, und alles Weitere sollte aus dem Serum kommen. Ebendeshalb ist MEM bis heute nützlich für Virologie, Impfstoffproduktion und Untersuchungen zum Nährstoffbedarf, wo zusätzliche Bestandteile das Ergebnis verfälschen würden.

Es gibt zusätzlich eine Variante MEM mit Hanks-Salzen, identisch bis auf das Natriumhydrogencarbonat, das auf etwa 350 mg/L abgesenkt ist, damit es bei atmosphärischem CO2 eingesetzt werden kann (siehe den Abschnitt zu den Salzen weiter unten). Zwei weitere gängige Varianten sind MEM mit bereits zugesetzten nichtessenziellen Aminosäuren sowie 2x MEM für Überschichtungen in Plaque-Assays.

Standardformulierung von α-MEM (mit Nukleosiden; die Variante ohne Nukleoside ist identisch, abzüglich der acht Nukleoside):

Anorganische Salze und weitere Bestandteile

Aminosäuren (mg/L)

L-Alanin 25; L-Arginin·HCl 126; L-Asparagin·H2O 50; L-Asparaginsäure 30; L-Cystein·HCl·H2O 100; L-Cystin·2HCl 31; L-Glutaminsäure 75; Glycin 50; L-Histidin·HCl·H2O 42; L-Isoleucin 52; L-Leucin 52; L-Lysin·HCl 73; L-Methionin 15; L-Phenylalanin 32; L-Prolin 40; L-Serin 25; L-Threonin 48; L-Tryptophan 10; L-Tyrosin (als Dinatriumsalz-Dihydrat) 52; L-Valin 46.

Vitamine (mg/L)

Ascorbinsäure 50; i-Inositol 2; Cholinchlorid 1; D-Calciumpantothenat 1; Folsäure 1; Niacinamid 1; Pyridoxal·HCl 1; Thiamin·HCl 1; Riboflavin 0.1; Biotin 0.1; Vitamin B12 ~1.3.

Nukleoside (mg/L, in der Variante mit Nukleosiden)

Adenosin 10; Cytidin 10; Guanosin 10; Uridin 10; Thymidin 10; 2'-Desoxyadenosin 10; 2'-Desoxyguanosin 10; 2'-Desoxycytidin·HCl 11.

Zwei Gegensätze zu DMEM sollte man sich merken. α-MEM enthält ein Viertel der Glucose (1000 statt 4500 mg/L) und deutlich weniger Hydrogencarbonat (2200 statt 3700 mg/L, also 5% CO2 statt 10%). Dafür bringt es ein breiteres Nährstoffspektrum mit — Ascorbat, Biotin, B12, Liponsäure und das vollständige Spektrum der nichtessenziellen Aminosäuren —, von dem DMEM nichts enthält. α-MEM ist kein schwächeres DMEM, sondern ein anderer Entwurf.

Das ist die folgenreichste Wahl bei der Bestellung von α-MEM, und eine falsche Entscheidung ruiniert Selektionsexperimente unbemerkt.

Zellen synthetisieren Nukleotide auf zwei Wegen: über den De-novo-Weg, der Purine und Pyrimidine von Grund auf aufbaut und auf Dihydrofolatreduktase (DHFR) und Thymidylat-Synthase angewiesen ist, und über den Wiederverwertungsweg, der vorgefertigte Nukleoside mit Enzymen wie HGPRT und Thymidinkinase recycelt. Nukleoside im Medium speisen den Wiederverwertungsweg.

Nukleosidfreies α-MEM verwenden Sie, wenn der Wiederverwertungsweg blockiert sein muss oder wenn die De-novo-Synthese Ihr Selektionsmarker ist:

• DHFR-basierte Selektion in CHO-DXB11 und CHO-DG44. Diese Linien sind DHFR-defizient und können Nukleotide nicht de novo bilden. Sie überleben nur bei zugeführten Nukleosiden — nukleosidfreies α-MEM ist also genau der Selektionsdruck, der jene Zellen erkennbar macht, die einen DHFR-tragenden Expressionsvektor aufgenommen haben. Werden Nukleoside zugesetzt, ist die Selektion vollständig ausgehebelt. Das ist der klassische Anwendungsfall und der Grund, weshalb α-MEM ohne Nukleoside ein Standardreagenz der Bioproduktion ist.
• Methotrexat-Amplifikation. Dieselbe Logik: Methotrexat hemmt die DHFR, und Nukleoside im Medium würden genau die Zellen retten, gegen die selektiert werden soll.
• HAT- und HT-Selektion in der Hybridomarbeit, bei der gesteuert werden soll, welcher Weg verfügbar ist.

Nukleosidhaltiges α-MEM verwenden Sie, wenn Sie schlicht ein reiches Medium wollen: für die routinemäßige Expansion mesenchymaler Stromazellen, Knochenmarkkulturen, das Wachstum von Primärzellen und die Erhaltung DHFR-defizienter Linien vor Beginn der Selektion. Die Nukleoside senken die Stoffwechsellast der Nukleotidsynthese und verbessern in der Regel das Wachstum anspruchsvoller Primärzellen.

Wenn Ihr Protokoll Nukleoside gar nicht erwähnt und Sie keine Selektion durchführen, ist die Variante mit Nukleosiden die sicherere Voreinstellung. Wenn in Ihrem Protokoll DHFR, Methotrexat, HAT oder HT vorkommen, lesen Sie genau — die Antwort lautet meist „ohne", und die beiden Produkte werden häufig verwechselt, weil ihre Katalogbezeichnungen sich nur um ein Wort unterscheiden.

MEM wird auf zwei verschiedenen Salzbasen geliefert, und der Unterschied betrifft ausschließlich die Frage, wo die Kultur stehen soll.

MEM mit Earle-Salzen enthält 2200 mg/L Natriumhydrogencarbonat und ist für einen Inkubator mit 5% CO2 ausgelegt. Das ist die Standardform im Labor und das, was „MEM" ohne weitere Angabe bedeutet. α-MEM nutzt diese Basis.

MEM mit Hanks-Salzen enthält nur etwa 350 mg/L Natriumhydrogencarbonat und ist für geschlossene Gefäße oder atmosphärisches CO2 gedacht — historisch für den Transport von Gewebe, für die Kultur in geschlossenen Flaschen und für Arbeitsschritte auf der offenen Werkbank. Wer MEM auf Hanks-Basis in einer belüfteten Flasche in einen Inkubator mit 5% CO2 stellt, sieht den pH-Wert unter die Kapazität des Puffers fallen.

Die Regel gilt über MEM hinaus: Hydrogencarbonatgehalt und CO2 im Inkubator sind ein aufeinander abgestimmtes Paar, weil der pH-Wert in diesen Medien durch das Verhältnis von Hydrogencarbonat zu gelöstem CO2 festgelegt wird. Wenn Ihnen auf einem Datenblatt ein unerwartet niedriger Hydrogencarbonatwert begegnet, prüfen Sie zuerst, ob es sich um eine Formulierung auf Hanks-Basis oder für geschlossene Gefäße handelt, bevor Sie das Medium in den Inkubator stellen.

Mesenchymale Stromazellen (MSC). α-MEM ist die Standardbasis für die Expansion humaner und tierischer MSC aus Knochenmark und Fettgewebe, meist mit 10–20% FBS oder einem definierten Zusatz. Der niedrige Glucosegehalt ist hier ein Vorteil — hohe Glucose hat dokumentierte Auswirkungen auf Proliferation und Differenzierungspotenzial von MSC.

Knochen- und hämatopoetische Kulturen. Osteoblasten, Assays zur Osteoklastendifferenzierung, stromale Knochenmarkkulturen und Langzeitkulturen des Knochenmarks nutzen üblicherweise α-MEM. Der Ascorbatgehalt ist für Arbeiten an Osteoblasten unmittelbar relevant, da Ascorbat für die Kollagenhydroxylierung und die Matrixablagerung benötigt wird.

CHO-DXB11 und CHO-DG44. Wie oben beschrieben ist α-MEM mit und ohne Nukleoside das Standardpaar für die DHFR-Selektion und die Methotrexat-Amplifikation in diesen Produktionslinien.

Primärzellen allgemein. Chondrozyten, Zellen der Zahnpulpa, Feeder-Schichten für Keratinozyten, primäre Fibroblasten und viele weitere Primärkulturen gedeihen in α-MEM besser als in reinem MEM, und zwar wegen der nichtessenziellen Aminosäuren, des Pyruvats, des Ascorbats und der Nukleoside.

Reines MEM bleibt dort im Einsatz, wo eine minimale, gut definierte Basis erwünscht ist — in Virologie und Impfstoffproduktion auf Vero und MRC-5, in Plaque-Assays und in Untersuchungen zum Nährstoffbedarf, bei denen zusätzliche Bestandteile das Ergebnis verfälschen würden.

Beachten Sie das Calcium: α-MEM enthält 1.8 mM, genauso viel wie DMEM. Das passt zu adhärenten und differenzierenden Kulturen, macht es aber zu einer schlechten Basis für Keratinozytenprotokolle, die einen niedrigen Calciumgehalt vorschreiben.

CO2. Die 2200 mg/L (26 mM) Hydrogencarbonat in α-MEM sind auf 5% CO2 abgestimmt. Das ist die Standardeinstellung des Inkubators, weshalb α-MEM den pH-Wert von vornherein verlässlicher hält als DMEM.

Glutamin. 2 mM (292 mg/L) in glutaminhaltigen Formulierungen. Glutamin zerfällt in Lösung zu Ammoniak, weshalb glutaminfreies Medium mit frischem Zusatz oder das stabile Dipeptid L-Alanyl-L-Glutamin eine konsistentere Langzeitkultur ergibt — besonders relevant für die MSC-Expansion, die über Wochen läuft.

Serum. 10% FBS sind typisch; MSC-Protokolle sehen häufig 15–20% vor und für Arbeiten in klinischer Qualität zunehmend einen definierten Zusatz oder humanes Thrombozytenlysat.

Stabilität des Ascorbats. Die 50 mg/L Ascorbinsäure in α-MEM sind wirklich nützlich, aber auch wirklich instabil — sie oxidieren in Lösung binnen Tagen bis Wochen. Für die osteogene Differenzierung, bei der Ascorbat die Kollagenablagerung antreibt, setzen Sie frisches Ascorbat-2-phosphat zu, statt sich auf das zu verlassen, was in einer seit einem Monat geöffneten Flasche übrig ist. Ascorbat-2-phosphat ist genau aus diesem Grund die stabilisierte Form in Differenzierungsprotokollen.

Lagerung. 2–8 °C im Dunkeln, ungeöffnet typischerweise 12–24 Monate. Nach Zugabe von Glutamin etwa vier Wochen. α-MEM ist lichtempfindlicher als reines MEM, weil Ascorbat, Riboflavin und Folat allesamt durch Licht abgebaut werden. Bewahren Sie es in einem geschlossenen Kühlschrank auf.

α-MEM als Pulvermedium wird ohne Natriumhydrogencarbonat geliefert; geben Sie beim Ansetzen 2.2 g/L zu, stellen Sie den pH-Wert etwa 0.2 Einheiten unter den Zielwert ein, um den Anstieg während der Filtration auszugleichen, und filtrieren Sie steril bei 0.22 µm.

Die falsche Nukleosid-Variante bestellen. Die beiden Produkte unterscheiden sich in der Katalogbezeichnung um ein Wort und im Verhalten unter DHFR- oder Methotrexat-Selektion vollständig. Prüfen Sie das Datenblatt, nicht das Regaletikett.

α-MEM für ein glucosearmes DMEM halten. Das ist es nicht. Anderer Hydrogencarbonatgehalt (2200 statt 3700 mg/L), anderer CO2-Bedarf, anderes Vitaminspektrum, und es enthält Nukleoside, Ascorbat, Liponsäure und Pyruvat, die DMEM fehlen.

Sich für Differenzierungsversuche auf das Ascorbat der Flasche verlassen. Ascorbinsäure zerfällt in Lösung. Für osteogene Arbeiten verwenden Sie Ascorbat-2-phosphat als frischen Zusatz.

MEM mit Hanks-Salzen in einen CO2-Inkubator stellen. Seine 350 mg/L Hydrogencarbonat können bei 5% CO2 nicht puffern, und die Kultur säuert an.

MSC-Kulturen mitten in der Studie zwischen α-MEM und DMEM wechseln. Glucose, Calcium und Mikronährstoffgehalt ändern sich alle; Proliferationsrate und Differenzierungspotenzial verschieben sich mit.