RPMI 1640 Medium

RPMI 1640 wurde von George Moore, Robert Gerner und H. Addison Franklin am Roswell Park Memorial Institute in Buffalo, New York, entwickelt und 1967 in einer Arbeit über die Kultur normaler humaner Leukozyten veröffentlicht. RPMI sind die Initialen des Instituts; 1640 ist die Formulierungsnummer innerhalb einer Reihe. Das Medium entstand als Abwandlung von McCoy's 5A (das selbst mitunter als RPMI 1630 bezeichnet wird) und zielte genau auf ein Problem, das die von Eagle abgeleiteten Medien schlecht lösten: die Kultur lymphoblastoider Zellen in Suspension.

Dieser Ursprung erklärt fast jede Besonderheit des Mediums. Suspensionszellen brauchen das anheftungsfördernde hohe Calcium nicht — es hemmt sie sogar. Leukozyten, die über Tage kultiviert werden, brauchen ein Puffersystem, das bei den CO2-Konzentrationen eines Standardinkubators trägt. Und das Medium musste Zellen versorgen, die auf den Redoxzustand empfindlich reagieren; deshalb enthält es reduziertes Glutathion, einen unter den klassischen Basalmedien nahezu einzigartigen Bestandteil.

RPMI 1640 hat sich seither als weit vielseitiger erwiesen, als sein Name vermuten lässt. Es trägt viele adhärente Linien problemlos und ist die Standardbasis für das NCI-60-Tumorpanel, für die Hybridomkultur, für Arbeiten mit mononukleären Zellen des peripheren Blutes und für die meisten humanen Leukämie- und Lymphomlinien.

Die Standardformulierung von RPMI 1640, wie sie alle großen Hersteller liefern:

Anorganische Salze und Hauptbestandteile

Aminosäuren (mg/L)

L-Arginin 200; L-Asparagin 50; L-Asparaginsäure 20; L-Cystin·2HCl 65; L-Glutaminsäure 20; Glycin 10; L-Histidin 15; L-Hydroxyprolin 20; L-Isoleucin 50; L-Leucin 50; L-Lysin·HCl 40; L-Methionin 15; L-Phenylalanin 15; L-Prolin 20; L-Serin 30; L-Threonin 20; L-Tryptophan 5; L-Tyrosin-Dinatriumsalz-Dihydrat 29; L-Valin 20.

Vitamine (mg/L)

i-Inositol 35; Cholinchlorid 3; para-Aminobenzoesäure 1; Folsäure 1; Niacinamid 1; Thiamin·HCl 1; D-Calciumpantothenat 0.25; Biotin 0.2; Riboflavin 0.2; Vitamin B12 (Cyanocobalamin) 0.005.

Vier Punkte dieser Liste verdienen besondere Beachtung, denn sie machen RPMI zu RPMI:

• Der Calciumgehalt ist sehr niedrig. 0.42 mM gegenüber 1.8 mM in DMEM und MEM. Das ist Absicht — wenig Calcium unterdrückt die Zell-Zell- und Zell-Substrat-Adhäsion, die eine Suspensionskultur zunichtemachen würde.
• Der Phosphatgehalt ist sehr hoch. Etwa 5.6 mM allein aus Dinatriumhydrogenphosphat, rund das Sechsfache von DMEM. Das verleiht RPMI eine spürbare sekundäre Pufferkapazität jenseits des Hydrogencarbonats und trägt zu seiner Stabilität im Laboralltag bei.
• Reduziertes Glutathion ist enthalten, mit 1 mg/L. Kein anderes klassisches Basalmedium führt es. Es liefert antioxidative Kapazität, was für primäre Leukozyten relevant ist.
• Biotin, Vitamin B12, PABA und Hydroxyprolin sind enthalten — keiner dieser Bestandteile kommt in DMEM oder MEM vor. Die Vitaminabdeckung von RPMI ist breiter als die der von Eagle abgeleiteten Medien, obwohl die Aminosäurekonzentrationen deutlich niedriger liegen.

Ebenso wichtig ist, was fehlt: RPMI enthält weder eine Eisenquelle noch Spurenelemente. Diese liefert das Serum.

Dies sind die beiden meistgenutzten Basalmedien, und sie sind nicht austauschbar. Die wesentlichen Unterschiede betreffen Calcium, Phosphat, Glucose, Aminosäurekonzentration und Hydrogencarbonat — die Vergleichstabelle auf dieser Seite zeigt den Bestandteilsvergleich.

In der Praxis läuft die Entscheidung meist auf drei Fragen hinaus.

Wächst die Kultur in Suspension oder adhärent? Lymphoide und hämatopoetische Suspensionszellen gehören in RPMI. Fest anhaftende Fibroblasten- und Epithellinien gehören in DMEM. Der niedrige Calciumgehalt von RPMI wirkt einer festen Anheftung entgegen; die 1.8 mM Calcium in DMEM unterstützen sie.

Was sagt das publizierte Protokoll der Linie? Bei etablierten Linien ist das keine Geschmacksfrage. Jurkat, K562, THP-1, Raji, U937, HL-60, MOLT-4, die meisten Mitglieder des NCI-60-Panels und die meisten Hybridome führen RPMI 1640 in ihren Referenzprotokollen. HEK293, HeLa, NIH/3T3, Vero, COS-7 und C2C12 führen DMEM. Ein Wechsel zwischen beiden verändert Verdopplungszeit, Sättigungsdichte und häufig auch die Proteinexpression und macht damit den Vergleich mit der Literatur ungültig, solange Sie nicht neu charakterisieren.

Wie hoch ist der Stoffwechselbedarf? DMEM mit 25 mM Glucose und etwa der vierfachen Aminosäurekonzentration von RPMI ist für dichte, schnelle, anspruchsvolle Kulturen ausgelegt. RPMI mit 11 mM Glucose und moderaten Aminosäuregehalten ist für Zellen gebaut, die über Tage mit mittlerer Rate in Suspension wachsen. Wer eine anspruchsvolle Kultur in RPMI treibt, muss häufiger füttern.

Eine wirklich nützliche Zwischenform gibt es: das ATCC-modifizierte RPMI 1640, das die Glucose auf 4.5 g/L anhebt und 1 mM Natriumpyruvat sowie 10 mM HEPES ergänzt. Es behält den ionischen Charakter von RPMI und bietet zugleich das Nährstoffreservoir eines glucosereichen Mediums — eine gute Wahl für Hybridome und andere RPMI-abhängige Kulturen, die zu hoher Dichte wachsen.

Etablierte lymphoide und hämatopoetische Linien. Jurkat, K562, HL-60, THP-1, U937, Raji, Ramos, MOLT-4, Daudi sowie die meisten B- und T-lymphoblastoiden Linien. Der Standardzusatz sind 10% FBS und 2 mM L-Glutamin.

Primäre humane Leukozyten. PBMC, isolierte T-Zellen, B-Zellen, Monozyten und Kulturen dendritischer Zellen. Das war der ursprüngliche Auslegungsfall von RPMI. Für lange Primärkulturen sind der Glutathiongehalt und die breite Vitaminabdeckung von RPMI echte Vorteile.

Hybridome und Antikörperproduktion. RPMI 1640, häufig mit zusätzlichen Ergänzungen, ist die klassische Hybridombasis. Für die Produktion sind chemisch definierte Hybridommedien heute die Regel, doch für Fusion und Klonierung bleibt RPMI der Standard.

Viele adhärente Tumorzelllinien. MCF-7, A549, PC-3, HT-29, SK-MEL und sehr viele weitere werden routinemäßig in RPMI gehalten. Es gibt keine Regel, dass RPMI nur für Suspensionszellen taugt; das NCI-60-Panel wird sowohl in seinen adhärenten als auch in seinen Suspensionsmitgliedern in RPMI kultiviert.

Wo RPMI eine schlechte Wahl ist: bei Zellen, die für die Ausbildung von Zellkontakten oder für die Differenzierung viel Calcium brauchen; bei Fed-Batch-Prozessen sehr hoher Dichte ohne modifizierte Formulierung; und beim klonalen Wachstum bei niedriger Dichte ohne Serum, wofür eine von F-12 abgeleitete oder eigens entwickelte Basis nötig ist.

Die 2000 mg/L (23.8 mM) Natriumhydrogencarbonat in RPMI 1640 sind auf eine Atmosphäre mit 5% CO2 abgestimmt, also auf die Einstellung nahezu jedes Inkubators. Das ist einer der stillen praktischen Vorteile von RPMI gegenüber DMEM, dessen 3700 mg/L Hydrogencarbonat für 10% CO2 formuliert wurden und bei 5% deshalb im alkalischen Bereich liegen.

Der hohe Phosphatgehalt von RPMI liefert zusätzlich einen sekundären Puffer, der unabhängig von CO2 arbeitet; das Medium verträgt Standzeiten auf der Werkbank daher besser als ein phosphatarmes Medium gleichen Hydrogencarbonatgehalts. Offen stehend verliert es dennoch CO2 und driftet ins Alkalische — halten Sie die Zeit mit offener Flasche kurz.

HEPES-Varianten werden mit 25 mM geliefert (oder mit 10 mM in der ATCC-Modifikation). Setzen Sie sie für Durchflusszytometrie, Lebendzellmikroskopie, längere Sortierläufe oder jedes Protokoll ein, das Zellen länger als wenige Minuten aus der CO2-Atmosphäre nimmt. Zwei Einschränkungen gelten: HEPES bildet unter Lichteinwirkung Wasserstoffperoxid, und bei 25 mM ist es für manche Primärzellen toxisch. Behandeln Sie es nicht als kostenlose Verbesserung.

Phenolrotfreies RPMI gibt es für Fluoreszenz- und Absorptionsmessungen, für die Durchflusszytometrie, in der Phenolrot den Hintergrund anhebt, und für Arbeiten zur Hormonantwort — Phenolrot hat eine schwache östrogene Wirkung, ein dokumentierter Störfaktor bei Östrogenrezeptor-positiven Linien wie MCF-7.

Serum. 10% FBS sind Standard; manche Protokolle verwenden 20% für Primär- oder Niedrigdichtekulturen und 5% für gut adaptierte Linien.

Glutamin. In der glutaminhaltigen Lieferform enthält RPMI 300 mg/L (etwa 2 mM). Da Glutamin in Lösung zu Ammoniak zerfällt, liefert glutaminfreies RPMI mit frischem Zusatz bei Gebrauch — oder das stabile Dipeptid L-Alanyl-L-Glutamin — konsistentere Ergebnisse, besonders bei Kulturen, die wöchentlich statt alle zwei Tage gefüttert werden.

2-Mercaptoethanol. 50 µM sind Standard für primäre Lymphozyten-, Hybridom- und murine T-Zell-Kulturen. Es unterstützt die Cystinaufnahme und hilft, das intrazelluläre Glutathion aufrechtzuerhalten. Für manche Primärkulturen ist das eine echte Anforderung und kein optionales Extra.

Natriumpyruvat und nichtessenzielle Aminosäuren. 1 mM Pyruvat und 1x NEAA sind gängige Zusätze, besonders für die NCI-60-Protokolle und für Kulturen mit reduziertem Serumanteil. RPMI enthält bereits mehrere nichtessenzielle Aminosäuren, sodass ein NEAA-Zusatz hier weniger bringt als bei DMEM.

Glucosefreies RPMI wird für Stoffwechselarbeiten genutzt — mit Galaktose als Ersatz, um den oxidativen Stoffwechsel zu erzwingen, oder zur Titration der Glucose auf einen definierten Wert. RPMI ist dafür die bessere Basis als DMEM, weil sein Ausgangsglucosewert von vornherein näher am physiologischen liegt.

RPMI als Pulvermedium ist der wirtschaftliche Weg im großen Maßstab. Es wird ohne Natriumhydrogencarbonat geliefert; dieses wird beim Ansetzen zugegeben (2.0 g/L), der pH-Wert wird etwa 0.1–0.2 Einheiten unter den Zielwert eingestellt, um den Anstieg während der Filtration auszugleichen, und die Lösung wird bei 0.22 µm sterilfiltriert.

Flüssiges RPMI 1640 wird bei 2–8 °C lichtgeschützt gelagert; die Haltbarkeit ungeöffnet beträgt typischerweise 12–24 Monate. Nach Zugabe von Glutamin rechnen Sie mit etwa vier Wochen Gebrauchsdauer, bei serumhaltigem Medium mit zwei bis vier Wochen.

Lichteinwirkung ist das am meisten unterschätzte Lagerungsproblem. Riboflavin, Folsäure und Tryptophan werden durch Licht abgebaut, und wo HEPES enthalten ist, entsteht dabei Wasserstoffperoxid. Medium, das im Laborlicht auf einem offenen Regal steht, verliert messbar an Plattierungseffizienz. Bewahren Sie Flaschen in einem geschlossenen Kühlschrank auf, nicht in einem beleuchteten Schaukühlschrank, und lassen Sie Arbeitsaliquots zwischen den Anwendungen nicht auf der Werkbank stehen.

Erwärmen Sie nur, was Sie brauchen. Eine volle 500 mL Flasche wiederholt auf 37 °C zu bringen, beschleunigt die Hydrolyse des Glutamins und treibt Hydrogencarbonat aus. Für die meisten Medienwechsel genügt Raumtemperatur.

Ein leichtes Nachdunkeln von Rosa nach Magenta, nachdem eine Flasche geöffnet war, ist normaler Hydrogencarbonatverlust und kehrt sich im Inkubator wieder um. Trübung, Partikel oder ein Umschlag nach Gelb in einer nicht beimpften Flasche sind nicht normal — verwerfen Sie sie und prüfen Sie Ihre Filtration oder Ihre aseptische Arbeitsweise, nicht das Medium.

Anzunehmen, RPMI sei nur etwas für Suspensionszellen. Ein großer Teil der adhärenten Tumorzelllinien wird routinemäßig darin gehalten.

Eine Linie mitten im Projekt von DMEM auf RPMI umzustellen (oder zurück). Wachstumsrate, Sättigungsdichte und die Expression mancher Gene ändern sich. Wenn Sie wechseln müssen, adaptieren Sie schrittweise über mehrere Passagen und erheben Sie Ihre Assays neu als Basiswerte.

2-Mercaptoethanol bei primärer Lymphozyten- oder Hybridomkultur zu vergessen. Sein Fehlen ist ein häufiger Grund, weshalb primäre T-Zell-Kulturen hinter den Erwartungen zurückbleiben.

RPMI für Zellen zu verwenden, die Calcium brauchen. Mit 0.42 mM trägt RPMI weder die Ausbildung von Zellkontakten noch die calciumgesteuerte Differenzierung, auf die manche Epithelprotokolle angewiesen sind.

Die ATCC-Modifikation wie normales RPMI zu behandeln. Sie unterscheidet sich in Glucose (4.5 statt 2.0 g/L), Pyruvat und HEPES. Halten Sie fest, welche Variante Sie verwendet haben.

Glutamin zuzugeben und die Flasche nicht zu datieren. Ammoniak aus dem Glutaminzerfall reichert sich an und ist für lymphoide Zellen schon in niedrigeren Konzentrationen toxisch, als viele adhärente Linien vertragen.