Rinderserum in der Zellkultur

Ein Basalmedium wie DMEM oder RPMI liefert Salze, Glucose, Aminosäuren und Vitamine. Es liefert nicht die Signale, die einer Zelle sagen, dass sie wachsen soll, und für die meisten Primärzellen und viele etablierte Linien reicht es allein nicht aus. Serum füllt diese Lücke mit einem komplexen, undefinierten Gemisch aus mehreren tausend verschiedenen Proteinen.

Funktionell wichtig sind folgende Beiträge:

• Wachstumsfaktoren und Hormone -- insulinähnliche Wachstumsfaktoren, PDGF, EGF, FGF, Hydrocortison, Schilddrüsenhormone und weitere --, die Vermehrung und Überleben antreiben.
• Anheftungsfaktoren, vor allem Fibronectin und Vitronectin, die verankerungsabhängigen Zellen das Anhaften und Ausbreiten auf Kunststoff ermöglichen.
• Transportproteine, insbesondere Albumin und Transferrin. Albumin trägt Fettsäuren, Hormone und Spurenelemente und puffert giftige Verbindungen ab; Transferrin liefert Eisen, das zugleich unentbehrlich und in freier Form toxisch ist.
• Lipide -- Cholesterin, Phospholipide und Fettsäuren --, die viele Zelllinien nicht in ausreichender Menge selbst herstellen können.
• Proteaseinhibitoren, namentlich Alpha-1-Antitrypsin und Alpha-2-Makroglobulin, die restliches Trypsin nach der Subkultivierung neutralisieren. Genau deshalb wird serumhaltiges Medium zum Abstoppen der Trypsinierung verwendet.
• Spurenelemente und Antioxidantien, darunter Selen.
• Physikalischer Schutz, besonders in gerührter oder begaster Kultur, wo Serumproteine Scher- und Blasenschäden verringern.

Üblich sind 10 % (v/v) für die Routinearbeit, wobei viele etablierte Linien auch bei 5 % gut wachsen und manche Prozesse mit 2 % oder weniger laufen. Den Serumanteil zu senken, wo eine Linie das verträgt, spart Geld, senkt den Proteinhintergrund in Ihren Proben und verringert die Abhängigkeit von Chargenschwankungen.

Das prägende Merkmal von Serum ist, dass es undefiniert ist. Niemand, auch der Hersteller nicht, weiß genau, was in einer bestimmten Charge steckt. Genau das ist zugleich der Grund für die breite Wirksamkeit und für die vielen Probleme.

Fötales Rinderserum (FBS) und fötales Kälberserum (FCS) sind dasselbe Produkt. Die beiden Bezeichnungen werden austauschbar verwendet, wobei FCS in Europa und FBS in Nordamerika geläufiger ist. Es gibt keinen Unterschied im Material, und wer sie als getrennte Qualitäten anbietet, beschreibt keine echte Unterscheidung. Das ist eine der am häufigsten gestellten Fragen zum Thema Serum, und die Antwort ist tatsächlich so einfach.

Die Rinderseren unterscheiden sich nach dem Alter des Tieres, und dieser Unterschied bestimmt alles Weitere:

Fötales Rinderserum wird vom Fötus gewonnen, wenn eine trächtige Kuh zur Lebensmittelgewinnung geschlachtet wird. Da der Fötus immunologisch unerfahren ist und sich rasch entwickelt, ist FBS arm an Immunglobulinen und Komplement und reich an Wachstumsfaktoren. Diese Kombination -- starke Wachstumsförderung bei minimal störenden Antikörpern -- hat es zum Standard gemacht und rechtfertigt den höchsten Preis.

Neugeborenen-Kälberserum (NBCS) stammt von Kälbern unter etwa 20 Tagen. Es enthält mehr Gesamtprotein und erheblich mehr IgG als FBS, überwiegend aus dem Kolostrum, und weniger Wachstumsfaktoren. Es ist deutlich günstiger und eignet sich gut für robuste, anspruchslose Linien.

Spenderrinderserum wird von Tieren im Alter von rund 12-36 Monaten gewonnen, die in einer kontrollierten, geschlossenen Spenderherde eigens zur Blutgewinnung gehalten werden. Die kontrollierte Herde ergibt eine bessere Gleichmäßigkeit und Gesundheitsdokumentation als Material aus dem Schlachthof.

Adultes Rinderserum stammt von ausgewachsenen Rindern und hat den höchsten Immunglobulingehalt und die geringste wachstumsfördernde Wirkung. Es ist am günstigsten und eignet sich nur für die robustesten Anwendungen.

Die Auswahl. Gehen Sie nicht davon aus, dass FBS erforderlich ist. Viele lange etablierte Linien wurden historisch an FBS gewöhnt und wachsen auf Neugeborenen-Kälberserum ebenso gut, zu einem Bruchteil der Kosten und mit weniger Druck auf eine angespannte Lieferkette. Der richtige Weg ist zu prüfen: Führen Sie Ihre Linie über mehrere Passagen parallel auf FBS und auf einem günstigeren Serum und messen Sie Wachstumsrate, Morphologie und den funktionellen Endpunkt, auf den es Ihnen ankommt. Wo das günstigere Serum gleichwertig abschneidet, ist der Wechsel geschenktes Geld. Wo nicht, wissen Sie nun, wofür Sie beim FBS bezahlen.

Die geografische Herkunft ist aus regulatorischen und nicht aus Leistungsgründen wichtig. Australien und Neuseeland haben den besten Länderstatus hinsichtlich transmissibler spongiformer Enzephalopathien, und ihr Serum ist entsprechend teuer; Ware aus den Vereinigten Staaten und aus Südamerika ist ebenfalls weit verbreitet. Wo die Herkunft für Ihre Anwendung zählt, muss sie im Analysenzertifikat dokumentiert und darf nicht vorausgesetzt werden.

Sterilfiltration. Serum wird über aufeinanderfolgende Membranen bis 0.1 um filtriert, üblicherweise dreifach, um Bakterien und Mykoplasmen zu entfernen. Die Trenngrenze von 0.1 um statt der sonst üblichen 0.2 um wird gerade deshalb gewählt, weil Mykoplasmen einen 0.2-um-Filter passieren können.

Hitzeinaktivierung: 56 °C für 30 Minuten. Das ist die Standardbedingung, und ihr Zweck ist eng gefasst -- die Aktivität des Komplementsystems zu zerstören und dabei die wachstumsfördernden Eigenschaften weitgehend zu erhalten. Das Komplementsystem ist eine Kaskade von Serumproteinen, die Zellen lysieren kann, sobald Antikörper sie aktivieren; das ist in immunologischen Untersuchungen von Bedeutung.

Die Hitzeinaktivierung wird weit häufiger angewandt als nötig, überwiegend aus Gewohnheit und aus älteren Vorschriften übernommen. Wirklich nötig ist sie für komplementempfindliche Arbeiten: immunologische und Zytotoxizitätsuntersuchungen mit Antikörpern, Studien zur komplementvermittelten Lyse und manche Primärkulturen von Immunzellen. Meist unnötig ist sie für die Routinekultur etablierter Linien, und sie ist nicht kostenlos -- die Erwärmung baut einige Wachstumsfaktoren ab, und hitzeinaktiviertes Serum erzeugt verlässlich mehr Niederschlag und flockiges Material. Wenn Sie hitzeinaktivieren, weil die übernommene Vorschrift es so verlangt, lohnt es sich zu prüfen, ob es für Ihre Zellen überhaupt einen Unterschied macht. Viele Labore stellen fest, dass es das nicht tut. Beachten Sie außerdem: Die Hitzeinaktivierung ist kein Sterilisations- und kein Virusabreicherungsschritt; sie ersetzt weder die Filtration noch die Bestrahlung.

Gammabestrahlung wird eingesetzt, um das Risiko von Fremdagenzien zu senken; validierte Verfahren liegen typischerweise im Bereich 25-45 kGy, mit berichteten Reduktionen um 6-8 Zehnerpotenzen für gängige Rinderviren und Mykoplasmen. Sie erfolgt am gefrorenen Serum, um Proteinschäden zu begrenzen. Bestrahltes Serum ist Standard für Anwendungen mit formaler Anforderung an die Virussicherheit und wird zunehmend auch allgemein verwendet. Ein gewisser Verlust an Wachstumsfaktoren tritt auf, daher sollte eine bestrahlte Charge wie jede andere im Leistungstest geprüft und nicht ohne Weiteres als gleichwertig zur unbestrahlten angesehen werden.

Niederschlag ist normal. Flockiges Material oder feine Partikel, die im aufgetauten Serum auftreten, sind fast immer kryopräzipitiertes Fibrin und Lipoprotein und keine Kontamination. Sie sind unbedenklich und können ignoriert oder durch Absetzenlassen entfernt werden; filtrieren Sie das Serum nicht selbst nach, denn das entzieht Proteine und riskiert, ein steriles Produkt zu verunreinigen. Hitzeinaktiviertes Serum fällt stärker aus als unbehandeltes.

Serum schwankt von Charge zu Charge. Zwei Chargen desselben Anbieters, derselben Herkunft und derselben Qualität können merklich unterschiedliche Wachstumsraten, Plattierungseffizienzen und Differenzierungsverhalten tragen. Für eine empfindliche Zelllinie oder eine lange Studie ist diese Schwankung eine echte Gefahr für die Reproduzierbarkeit -- ein Chargenwechsel mitten im Projekt kann Ergebnisse so verschieben, dass es sich im Nachhinein kaum noch aufklären lässt.

Vorgehen bei der Chargenprüfung:

1. Muster anfordern. Bitten Sie den Anbieter um 25-50 mL Prüfmuster von drei bis fünf aktuellen Chargen samt Analysenzertifikat.
2. Parallel testen, mit Ihrer bisherigen Charge als Referenz, mit Ihren eigenen Zellen, Ihrem eigenen Medium und Ihren eigenen Testverfahren. Herstellerdaten können das nicht ersetzen, weil sie an anderen Zellen erhoben wurden.
3. Messen, worauf es Ihnen ankommt. Mindestens: Wachstumsrate über mehrere Passagen, Plattierungs- oder Klonierungseffizienz und die erreichte lebende Enddichte. Ergänzen Sie den funktionellen Endpunkt, von dem Ihre Arbeit abhängt -- Differenzierung, Transfektionseffizienz, Virusausbeute, Antikörpertiter, Morphologie. Eine Charge, die schnelles Wachstum trägt, aber die Differenzierung blockiert, ist für ein Differenzierungslabor eine schlechte Charge.
4. Genügend Passagen fahren. Tests über eine einzige Passage übersehen kumulative Effekte. Drei bis fünf Passagen sind ein vernünftiges Minimum.
5. Die beste Charge reservieren. Anbieter halten eine reservierte Menge für einen festgelegten Zeitraum zurück. Reservieren Sie genug für das Projekt oder idealerweise für ein Arbeitsjahr.
6. Beim Wechsel überlappen. Wenn eine reservierte Charge zur Neige geht, prüfen Sie die Nachfolgecharge parallel gegen die alte, bevor Sie umstellen, statt umzustellen und zu hoffen.

Analysenzertifikat. Lesen Sie es, statt es abzuheften. Nützliche Angaben sind Endotoxin (üblich spezifiziert unter 10 EU/mL, bei endotoxinarmen Qualitäten unter 1 EU/mL), Hämoglobin als Hinweis auf Hämolyse bei der Gewinnung, Gesamtprotein, Osmolalität, pH-Wert, Sterilitäts- und Mykoplasmenprüfung, Virusprüfung und Herkunftsland.

Rückverfolgbarkeit. Die International Serum Industry Association betreibt ein Zertifizierungsprogramm zur Rückverfolgbarkeit, das die Kette vom Schlachthof bis zum Anwender durch unabhängige Audits Dritter belegen soll. Das ist wichtig, weil Falschdeklaration und Verfälschung von Serum -- Ware, die als höhere Qualität oder günstigere Herkunft verkauft wird, als sie tatsächlich hat -- in diesem Markt ein dokumentiertes Problem sind, angetrieben von großen Preisunterschieden zwischen den Herkunftsländern. Kaufen Sie bei Anbietern, die Herkunft und Lieferkette belegen können, und betrachten Sie eine ungewöhnlich billige Charge aus einer Premiumherkunft mit Misstrauen.

Lagerung und Handhabung. Bei -20 °C lagern. Über Nacht bei 2-8 °C auftauen oder bei Raumtemperatur beziehungsweise 37 °C unter gelegentlichem vorsichtigem Schwenken; lassen Sie Serum nicht längere Zeit bei 37 °C stehen und tauen Sie es nicht bei höheren Temperaturen auf. Portionieren Sie beim ersten Auftauen in Einzelmengen, denn wiederholtes Einfrieren und Auftauen schädigt das Serum und erzeugt Niederschlag. Schützen Sie es vor längerer Lichteinwirkung, die Riboflavin und einige weitere Bestandteile abbaut.

Woher fötales Rinderserum stammt. FBS ist ein Nebenprodukt der Rindfleischwirtschaft. Es werden keine Tiere zur Serumgewinnung gehalten. Wird eine Kuh geschlachtet, die sich als trächtig erweist, werden Gebärmutter und Fötus im Schlachthof entnommen und dem Fötus Blut entnommen, das anschließend zu Serum verarbeitet wird: gerinnen lassen, zentrifugieren, filtrieren, einfrieren. Das Herkunftsland bezeichnet den Ort dieser Gewinnung. Dieser Abschnitt beantwortet die Herkunftsfrage direkt, weil Forschende sie stellen und eine Anbieterseite, die ihr ausweicht, keine brauchbare Referenz ist.

Der Gewinnungsvorgang. Fötales Rinderserum ist ein Nebenprodukt der Rindfleischwirtschaft. Wird eine Kuh geschlachtet, die sich als trächtig erweist, wird der Fötus entnommen und das Blut durch Herzpunktion am nicht betäubten Fötus gewonnen. Die zentrale Tierschutzfrage ist, ob der Fötus den Vorgang empfinden kann. Wissenschaftlich ist das nicht abschließend geklärt; es hängt vom Entwicklungsstadium ab und davon, ob der Fötus nach der Trennung vom mütterlichen Kreislauf bewusstlos bleibt. Gremien wie das NC3Rs haben darauf hingewiesen, dass der Vorgang nicht umfassend geregelt ist -- die EU-Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere erfasst die Gewinnung am Fötus nicht eindeutig -- und dass es nur begrenzte Belege dafür gibt, dass bestehende Leitlinien die Tiere in der Praxis schützen. Vernünftige Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler beurteilen die Schwere unterschiedlich, doch es handelt sich weder um eine erfundene Kontroverse noch um eine erledigte Frage.

Das Reproduzierbarkeitsargument ist von der Ethik unabhängig und für viele Labore unmittelbar überzeugender. Serum ist undefiniert und schwankend. Verschiedene Chargen enthalten Hunderte bioaktiver Moleküle in unterschiedlicher Konzentration. Historische Aufzeichnungen zeigen, dass dies sehr früh erkannt wurde -- Puck beobachtete, dass toxische Faktoren im Serum in unterschiedlichem Maß auftreten, dass jede Charge geprüft werden muss und dass in manchen Jahreszeiten gewonnenes Serum zu einem hohen Anteil verworfen werden musste. Wenn jede beliebige Charge das Verhalten der Zellen verändern kann, dann sitzt mit dem Serum eine unkontrollierte Variable mitten in praktisch jedem Experiment -- eine, die sich in einem Methodenteil auf keine sinnvolle Weise berichten lässt. "10 % FBS" beschreibt so gut wie nichts.

Versorgung und Preis. Das FBS-Angebot hängt an den Schlachtmengen und an der Häufigkeit von Trächtigkeit bei der Schlachtung, und beides reagiert nicht auf die Nachfrage der Lebenswissenschaften. Der Markt hat wiederholt Preissprünge und Engpässe erlebt. Für einen Prozess, der in Richtung Produktion skaliert wird, ist das ein echtes unternehmerisches Risiko und nicht bloß eine Unannehmlichkeit.

Regulatorische Richtung. Behörden und Fördergeber erwarten in der Herstellung von Biologika und Zelltherapien zunehmend Rohstoffe frei von tierischen Bestandteilen -- sowohl um das Risiko von Fremdagenzien auszuschließen als auch um die Prozesskontrolle zu verbessern. Ein auf Serum aufgebauter Forschungsprozess muss später ohne Serum neu entwickelt werden, wenn er sich der Klinik nähert, und das spät zu tun ist deutlich teurer, als es früh zu tun.

Alternativen, ehrlich bewertet.

• Chemisch definierte und serumfreie Medien sind die stärkste Option, wo es sie für Ihren Zelltyp gibt. Für CHO, HEK293, Hybridome, Insektenzellen und viele weitere Arbeitspferde gibt es hervorragende kommerzielle serumfreie und von tierischen Bestandteilen freie Medien, und im Bioprozess übertreffen sie serumhaltiges Medium regelmäßig bei Ausbeute, Gleichmäßigkeit und nachgeschalteter Aufreinigung. Für diese Zellen ist die Diskussion über Serum im Grunde beendet.
• Definierte Zusätze -- rekombinantes humanes Albumin, rekombinantes Insulin, rekombinantes Transferrin, ITS-Mischungen, chemisch definierte Lipide -- bauen die Schlüsselfunktionen des Serums aus bekannten Bestandteilen nach. So sind die meisten serumfreien Formulierungen aufgebaut.
• Humanes Thrombozytenlysat (hPL) ist ein gut etablierter Ersatz für FBS in der Kultur mesenchymaler Stromazellen und trägt oft eine schnellere Vermehrung als FBS. Es ist human und nicht vollständig definiert, tauscht also ein variables Material gegen ein anderes, beseitigt aber die ethischen und sicherheitsbezogenen Probleme des Rinderserums und wird klinisch eingesetzt.
• Die Senkung des Serumanteils ist ein zu wenig genutzter Zwischenschritt. Viele Linien vertragen 5 % oder 2 % ohne messbaren Nachteil. Das steht sofort zur Verfügung, erfordert keine Anpassungsarbeit und senkt Kosten und Schwankungen bereits heute.

Die ehrliche Einschränkung. Serumfreie Alternativen gibt es nicht für jeden Zelltyp, und die Anpassung kostet Zeit und kann scheitern. Manche Primärzellen und manche schlecht charakterisierten Linien brauchen wirklich noch Serum, und etwas anderes zu behaupten hilft niemandem. Vertretbar ist nicht die Position, dass Serum nie verwendet werden darf, sondern dass es eine bewusste Entscheidung für Zellen sein sollte, die es brauchen, statt eine Voreinstellung für Zellen, die es nicht brauchen -- und dass jede Linie, die in skalierte oder klinische Arbeit überführt wird, so früh wie praktikabel vom Serum weggeführt werden sollte.

Die Anpassung gelingt bei suspensionsadaptierten Produktionslinien meist unkompliziert und ist bei adhärenten Primärzellen schwieriger.

Die schrittweise Anpassung ist der übliche, risikoärmere Weg. Senken Sie den Serumanteil über die Passagen hinweg stufenweise -- etwa 10 %, 5 %, 2.5 %, 1 %, 0.5 %, 0 % -- und lassen Sie die Kultur vor jeder weiteren Senkung zu ihrer normalen Verdopplungszeit und zu über 90 % Lebensfähigkeit zurückfinden. Rechnen Sie mit mehreren Wochen. Gehen Sie nicht zur nächsten Stufe über, solange die Kultur noch kämpft.

Die direkte Anpassung -- der unmittelbare Wechsel in serumfreies Medium -- ist schneller und gelingt manchmal, besonders bei robusten Suspensionslinien in einem gut passenden kommerziellen Medium. Führen Sie parallel eine serumhaltige Sicherungskultur weiter, denn der Fehlerfall bedeutet den Verlust der Kultur.

Praktische Hinweise:

• Legen Sie vorher und nachher eine Bank an. Frieren Sie Kryoröhrchen vom Ausgangspunkt ein, falls die Anpassung scheitert, und legen Sie die angepasste Linie sofort ein, sobald sie stabil ist. Eine erfolgreich angepasste Linie zu verlieren ist ein schmerzhafter und vermeidbarer Fehler.
• Rechnen Sie mit einer langsameren Phase. Ein vorübergehender Einbruch der Wachstumsrate während der Anpassung ist normal; ein anhaltender bedeutet, dass die Stufe zu groß war.
• Die Anheftung kann sich ändern. Adhärenten Zellen fehlen ohne Serum Fibronectin und Vitronectin, sodass sie statt nacktem Kunststoff eine beschichtete Oberfläche brauchen können -- rekombinantes Vitronectin, Laminin oder eine definierte Anheftungsmatrix.
• Die Trypsinierung muss neu gedacht werden. Ohne Serum gibt es keine Proteaseinhibitoren, die das Trypsin neutralisieren; verwenden Sie daher einen definierten Trypsininhibitor oder ein rekombinantes Dissoziationsreagenz und verlassen Sie sich nicht allein auf Verdünnung.
• Der Schutz vor Scherkräften wird wichtiger. Serumfreie Suspensionskulturen brauchen meist ein Tensid wie Poloxamer 188 zum Schutz vor Schäden durch Begasung und Rühren. Die meisten kommerziellen serumfreien Medien enthalten eines; prüfen Sie das, bevor Sie es voraussetzen.
• Validieren Sie Ihre Testverfahren neu. Der Wegfall des Serums verändert den Proteinhintergrund, verändert das Verhältnis freier zu gebundener Konzentration aller zugesetzten Stoffe und kann die scheinbare Wirkstärke in einer Dosis-Wirkungs-Untersuchung verschieben. Vergleichen Sie serumfreie Ergebnisse nicht ungeprüft mit historischen serumhaltigen Daten.

Serumhaltig, serumfrei, frei von tierischen Bestandteilen und chemisch definiert -- diese Begriffe sind nicht austauschbar. Sie werden häufig unscharf verwendet, und die Unterschiede zählen, sobald ein Prozess spezifiziert wird:

Die praktische Rangfolge lautet serumhaltig, dann serumfrei, dann frei von tierischen Bestandteilen, dann chemisch definiert, wobei jede Stufe mehr Kontrolle bringt und meist mehr kostet. Ein Medium kann serumfrei sein und dennoch Rinderalbumin enthalten, und ein von tierischen Bestandteilen freies Medium kann dennoch ein undefiniertes pflanzliches Hydrolysat enthalten -- beides sind häufige Quellen von Verwirrung bei der Prozessspezifikation. Eine ausführlichere Darstellung definierter Formulierungen finden Sie in der Referenz zum chemisch definierten Medium.