Trypsin vs. Accutase: Das richtige Zelldissoziationsreagenz wählen

Trypsin ist eine Serinprotease aus dem Pankreas, die für die Zellkultur entweder als Extrakt aus Schweine- oder Rinderpankreas oder als rekombinantes Protein geliefert wird. Es hydrolysiert Peptidbindungen auf der Carboxylseite von Lysin- und Argininresten und arbeitet gut bei 37 °C und leicht alkalischem pH-Wert.

Bei der Dissoziation tut es zwei Dinge gleichzeitig. Es verdaut die extrazellulären Domänen der Adhäsionsproteine, die Zellen an der Kulturoberfläche und aneinander verankern, und es verdaut alles andere auf der Zelloberfläche, das ein zugängliches Lysin oder Arginin bietet. Der zweite Effekt ist der ganze Grund, weshalb es Alternativen gibt.

Die Angabe „1:250“ auf einem Trypsin-Etikett ist eine Wirkstärkeangabe, keine Verdünnung und keine Reinheitsangabe: Sie bedeutet, dass ein Teil der Zubereitung im standardisierten Assay 250 Teile Casein verdaut. Über den übrigen Inhalt der Flasche sagt sie nichts. Rohe Pankreaszubereitungen enthalten außerdem Chymotrypsin, Elastase, Carboxypeptidasen und weitere Pankreasaktivitäten, und sie schwanken von Charge zu Charge. Das ist wichtig zu wissen, wenn sich ein Protokoll nach dem Öffnen einer neuen Flasche plötzlich anders verhält. Rekombinantes Trypsin, durch Fermentation hergestellt, ist eine einzelne definierte Komponente und bringt diese Schwankung nicht mit.

Die Standardformulierungen sind überschaubar. Trypsin-EDTA 0.25 % von Gibco enthält 2.5 g/L Trypsin (1:250) mit 0.38 g/L EDTA-Tetranatrium — etwa 1 mM — in einer calcium- und magnesiumfreien Salzlösung. Die Variante mit 0.05 % enthält 0.5 g/L Trypsin mit 0.2 g/L EDTA-Tetranatrium, etwa 0.53 mM. Das EDTA ist kein Füllstoff: Es komplexiert die zweiwertigen Kationen, die Cadherine und Integrine benötigen, sodass Enzym und Chelator dieselben Adhäsionen auf verschiedenen Wegen angreifen.

Accutase ist eine Zellablöselösung von Innovative Cell Technologies. Ihre Wirkkomponenten werden als Mischung proteolytischer und kollagenolytischer Enzyme aus einer wirbellosen Art beschrieben. Die genaue Identität der Enzyme und ihre Konzentrationen sind proprietär und unveröffentlicht, sodass kein redlicher Vergleich eine Aktivitätsangabe in Einheiten dafür nennen kann — wer das tut, rät.

Offengelegt ist die Matrix. Die Enzyme werden in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium geliefert, mit 0.5 mM EDTA-Tetranatrium und 3 mg/L Phenolrot. Das Produkt enthält keine Bestandteile aus Säugetieren oder Bakterien, worauf sein Einsatz überall dort beruht, wo Material tierischen Ursprungs ein regulatorisches Problem ist.

Aus dieser Auslegung folgen drei praktische Eigenschaften. Accutase ist bei Raumtemperatur ebenso aktiv wie bei 37 °C, sodass die Dissoziation kühler und langsamer geführt werden kann, wo das der Lebensfähigkeit hilft. Es ist keine Neutralisation mit Serum oder einem Proteaseinhibitor erforderlich — der Standardablauf besteht darin, in Medium zu verdünnen und abzuzentrifugieren. Und Accutase ist deutlich schonender zu Oberflächenproteinen als Trypsin, und genau diese Eigenschaft bezahlen die meisten Anwender tatsächlich.

Der Preis dafür ist Geschwindigkeit. Accutase braucht in der Regel länger als Trypsin, um denselben Monolayer abzulösen, und bei fest anhaftenden Linien löst es sie unter Umständen gar nicht vollständig ab.

Die Frage wird meist als Trypsin gegen Accutase gestellt, aber zwei weitere Reagenzien gehören in die Entscheidung.

TrypLE ist eine rekombinante trypsinähnliche Protease, die durch mikrobielle Fermentation hergestellt und als Ersatz für Schweinetrypsin ohne Bestandteile tierischen Ursprungs verkauft wird. Wie bei Accutase ist die Enzymkonzentration proprietär. In der Aggressivität liegt TrypLE zwischen Trypsin und Accutase, ist sowohl für die Lagerung als auch für den Gebrauch bei Raumtemperatur stabil und ist der unkomplizierte Ersatz, wenn ein Prozess auf tierisches Material verzichten soll, ohne den Arbeitsablauf neu zu entwerfen. Es ist mit und ohne EDTA sowie mit und ohne Phenolrot erhältlich.

Reines EDTA — als Versene mit 0.48 mM EDTA in PBS verkauft oder als 0.5 mM EDTA-Lösung in calcium- und magnesiumfreier Kochsalzlösung — enthält überhaupt kein Enzym. Es wirkt ausschließlich durch Komplexierung von Ca2+ und Mg2+, wodurch cadherinvermittelte Zell-Zell-Kontakte und integrinvermittelte Anhaftung zusammenbrechen, ohne dass irgendetwas gespalten wird. Auf der Zelloberfläche wird nichts verdaut, der Epitoperhalt ist also vollständig.

Der Nachteil ist, dass reines EDTA Zellen in vielen Systemen nicht vollständig von der Matrix löst und sie als Klumpen statt als Einzelzellen ablöst. Für humane pluripotente Stammzellen ist das eher ein Vorzug als ein Mangel: Das Passagieren in Klumpen mit EDTA ist gerade deshalb die Standardroutine, weil hPSC als Aggregate besser überleben als als Einzelzellen.

Wenn die geernteten Zellen direkt zurück in eine Flasche gehen, spielt die Chemie der Dissoziation kaum eine Rolle — Oberflächenproteine werden innerhalb von Stunden neu exprimiert. Wenn die geernteten Zellen die Messung sind, spielt sie eine sehr große Rolle.

Trypsin spaltet die extrazellulären Domänen vieler Oberflächenproteine ab, die als Identitäts- und Linienmarker dienen. Als trypsinempfindlich werden häufig unter anderem CD4, CD8, CD14, CD19, CD31, CD62L (L-Selektin), CXCR4 und mehrere Integrine genannt. Die Empfindlichkeit hängt allerdings ebenso vom Antikörperklon ab wie vom Antigen: Zwei Antikörper gegen denselben Marker können sich nach der Trypsinierung völlig unterschiedlich verhalten, weil sie verschiedene Epitope darauf erkennen.

Die Folge ist ein durchflusszytometrisches Ergebnis, das einen Phänotyp ausweist, den die Zellen gar nicht haben. Eine als markernegativ bewertete Population hat das Epitop möglicherweise einfach bei der Ernte verloren. Dieser Fehler bleibt stumm — das Histogramm sieht wie eine echte negative Population aus, und nichts in den Daten weist darauf hin.

Es gibt drei Auswege. Verwenden Sie für die Ernte reines EDTA oder Accutase. Oder lassen Sie, wo Trypsin unvermeidlich ist, die Zellen vor der Färbung in vollständigem Medium erholen, damit das Oberflächenproteom neu exprimiert wird. Oder validieren Sie direkt, indem Sie dieselbe Probe auf beide Weisen ernten, färben und vergleichen — der einzige Weg, der die Frage für Ihr konkretes Panel tatsächlich beantwortet.

Ein verwandter Punkt, den man leicht übersieht: Welches Reagenz Sie auch wählen, halten Sie es über ein Experiment hinweg konstant. Eine behandelte Probe, die mit Trypsin geerntet wurde, und eine Kontrolle, die mit Accutase geerntet wurde, sind kein kontrollierter Vergleich, so gut alles Übrige auch abgestimmt sein mag.

Beide Fehlerrichtungen sind teuer.

Überverdauung — zu lange, zu konzentriert oder zu warm — schädigt die Plasmamembran. Sichtbare Anzeichen sind Blasenbildung, Granularität und Zellen, die sich abkugeln, aber nie ein sauberes Pellet bilden. Messbare Folgen sind verminderte Lebensfähigkeit, geringere Anwachseffizienz in der nächsten Passage und ein verzerrtes Markerprofil. Trypsin hört von selbst nicht auf zu arbeiten; deshalb ist der Neutralisationsschritt nicht optional, und deshalb geschieht die meiste Überverdauung tatsächlich zwischen dem Ende der Inkubation und dem Moment, in dem Medium zugegeben wird.

Unterverdauung erzeugt Klumpen. Klumpen verderben Zählungen in der Zählkammer wie am Zellzählgerät, was anschließend zu ungleichmäßiger Aussaat über eine Platte hinweg führt. In der tröpfchenbasierten Einzelzellsequenzierung verursachen sie Multipletts und verstopfen die Mikrofluidik. In der Durchflusszytometrie werden sie durch Dublettengating entfernt, sodass die verklumpten Zellen stillschweigend aus der Auswertung fallen — und wenn das Verklumpen nicht zufällig über die Zelltypen verteilt ist, ist das ein verzerrter Verlust und nicht bloß eine kleinere Stichprobe.

Praktisch heißt das: Legen Sie die Inkubationszeit nach Beobachtung fest, nicht nach Protokoll. Prüfen Sie den Monolayer ab dem frühesten plausiblen Zeitpunkt unter dem Mikroskop und stoppen Sie, wenn sich etwa 80–90 % der Zellen abgekugelt haben — das ist meist noch bevor sie sich vollständig abgelöst haben; ein fester Schlag gegen die Flaschenwand löst den Rest. Geben Sie in diesem Moment sofort Medium zu.

Die Temperatur ist ein wirksamer Hebel. Trypsin ist bei Raumtemperatur viel langsamer als bei 37 °C, was für empfindliche Zellen gelegentlich nützlich ist. Accutase und TrypLE sind für die Arbeit bei Raumtemperatur ausgelegt.

Noch eine Warnung: Trypsinlösungen verlieren durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen an Aktivität. Aliquotieren Sie bei Wareneingang, statt eine 500-mL-Flasche mehrfach durch den Gefrierschrank zu schicken — sonst funktioniert ein Protokoll, das im Januar lief, im Juni nicht mehr, und niemand weiß, warum.

Robuste adhärente Linien für das routinemäßige Passagieren — HEK293, HeLa, CHO, die meisten Fibroblasten- und Epithellinien. Trypsin-EDTA mit 0.25 % oder 0.05 % ist der sinnvolle Standard: am schnellsten, am günstigsten, und der Epitopschaden ist belanglos, wenn die Zellen zurück in Kultur gehen. Verwenden Sie 0.05 % für Linien, die sich leicht ablösen, und 0.25 % für hartnäckige.

Humane pluripotente Stammzellen (iPSC und ESC). Reines EDTA für das routinemäßige Passagieren in Klumpen; Accutase oder ein eigenes Stammzell-Dissoziationsreagenz, wenn wirklich Einzelzellen gebraucht werden, etwa für klonale Arbeiten, Transfektion oder Sortierung. Die Vereinzelung von hPSC löst dissoziationsbedingte Apoptose aus, und ein ROCK-Inhibitor wie Y-27632 ist gängige Praxis, um das zu verhindern — Watanabe und Kollegen berichteten von einem Anstieg der Klonierungseffizienz von etwa 1 % auf etwa 27 %. Trypsin ist für diese Zellen in beiden Betriebsarten eine schlechte Wahl.

Primäre Neurone und andere empfindliche Primärzellen. Accutase oder ein schonendes enzymfreies Reagenz. Neurone sind ungewöhnlich empfindlich sowohl gegenüber Überverdauung als auch gegenüber der anschließenden mechanischen Triturierung.

Zellen für die Durchflusszytometrie auf Oberflächenmarker. Reines EDTA, wenn es sie ablöst, Accutase, wenn nicht, und Trypsin nur mit Erholungsphase und validiertem Panel.

Mesenchymale Stromazellen und andere Zellen für Zelltherapie- oder GMP-nahe Prozesse. Ein Reagenz frei von tierischen Bestandteilen — rekombinantes Trypsin, TrypLE oder Accutase — beseitigt das Schweinematerial und den damit verbundenen Prüfaufwand auf Fremdagenzien.

Präparationen für die Einzelzellsequenzierung. Was für dieses Gewebe die sauberste Einzelzellsuspension bei höchster Lebensfähigkeit liefert, empirisch ermittelt. Schonender ist meist besser, aber eine unvollständig dissoziierte Probe ist schlechter als eine etwas grober behandelte.

Zuerst waschen, mit einer calcium- und magnesiumfreien Lösung. Serum enthält Alpha-1-Antitrypsin und Alpha-2-Makroglobulin, die Trypsin hemmen, sodass Serumreste den Verdau ausbremsen. Ein Waschschritt mit Ca/Mg-freiem DPBS entfernt das Serum und beginnt, die zweiwertigen Kationen aus den Zellkontakten zu ziehen. Mit einer Ca/Mg-haltigen Lösung an dieser Stelle zu waschen arbeitet direkt gegen Sie.

Nur so viel Volumen verwenden, dass der Monolayer bedeckt ist. Ein dünner Film genügt — typischerweise 1 mL für eine T-25 und 2–3 mL für eine T-75. Überschüssiges Reagenz kostet Geld und verbessert nichts.

Trypsin richtig neutralisieren. Üblich ist vollständiges, serumhaltiges Medium. Für serumfreie Kultur verwenden Sie einen definierten Sojabohnen-Trypsininhibitor, statt sich auf Verdünnung zu verlassen; Verdünnung bremst das Enzym, stoppt es aber nicht.

Accutase muss nicht neutralisiert, aber sehr wohl entfernt werden. Verdünnen Sie in Medium, zentrifugieren Sie ab und resuspendieren Sie, statt die Zellen darin stehen zu lassen, während Sie etwas anderes tun.

Schonend abzentrifugieren. Etwa 200–300 × g für 5 Minuten passt für die meisten Säugerzelllinien. Nach einem aggressiven Verdau härter zu zentrifugieren verstärkt den Membranschaden, statt ihn auszugleichen.

Führen Sie ein schriftliches, linienspezifisches Protokoll mit Reagenz, Konzentration, Temperatur, Zeit und dem visuellen Endpunkt. Die Dissoziation ist der Schritt, der zwischen Anwendern am ehesten unbemerkt abdriftet, und sie steht allem vor, was Sie danach messen.